[发明专利]用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的胶体金、金标抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及胶体金以及金标抗体复合物，尤其涉及用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的胶体金、金标抗体及其制备方法，属于羊痘病毒的检测领域。 

背景技术

羊痘病毒p32蛋白是目前世界各地分离鉴定的所有羊痘病毒株所共有的且特异性很强的结构蛋白，p32蛋白的体外表达是目前国际上研究的热点。羊痘病毒p32蛋白与晚期H3L基因编码的痘苗病毒的p35蛋白相类似,在成熟胞内病毒粒子的膜上表达，p35蛋白在病毒吸附、成熟病毒粒子的组装、病毒毒力、免疫原性等方面发挥着重要作用。山羊痘病毒P32基因包含969bp的开放阅读框,编码322个氨基酸；绵羊痘病毒p32基因包含972bp的开放阅读框,编码323个氨基酸。推导的氨基酸序列表明p32蛋白是高度保守的。P32基因包含一个与膜相关的靠近羧基末端的跨膜区，能被去污剂溶解，在ELISA抗体检测试验中能被用做捕捉抗原。免疫印迹研究显示，P32蛋白包含重要的抗原决定簇,诱导的抗体反应比其他结构蛋白超前并且优越,可以用于建立免疫学诊断技术。 

免疫胶体金技术(Immune Colloidal gold technique，ICG)即免疫金标记技术(Immune-gold labelling technique)，是以胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，与目前普遍采用的标记免疫分析方法(如:酶联免疫法、免疫荧光法、放射免疫测定方法)相比，具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，目前已得到广泛应用。在金免疫分析方法中，胶体金是非常重要的抗体标记物和信号输出试剂，胶体金的均匀度、分散性和稳定性与所建立的分析方法敏感度和稳定性有着密切的关系。 

胶体金的制备方法一般采用还原法，常见的有硼氢化钠还原法(2nm)、白磷还原法(5nm)、抗坏血酸还原法(8～12nm)、柠檬酸鞣酸还原法(3～15nm)、柠檬酸三钠还原法(10～150nm)。其中柠檬酸三钠法是最经典的方法，其基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的柠檬酸三钠使金离子还原变成金原子，其工艺简单，成本低廉，但在实际应用过程中很容易出现颗粒聚集、重复性差等问题，影响胶体金在免疫分析中的应用。 

此外，在建立快速免疫检测方法的过程中，金标抗体集反应载体和信号输出于一体，所以其合成和鉴定是不可或缺的技术环节，也是检测方法建立的基础，制备得到稳定而灵敏的金标抗体是决定最终检测技术是否成功的重要因素。 

发明内容

本发明的目的之一是提供具有良好的均一性、分散性和稳定性的胶体金； 

本发明的目的之二是提供一种用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的金标抗体复合物； 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种用于羊痘病毒胶体金检测试剂条的胶体金，所述胶体金通过枸橼酸三钠还原法制备得到，包括： 

（1）将l00mL的三蒸去离子水加热至沸腾，加入100mL1%HAuCL₄溶液，继续加热；（2）加入1.6-2.5mL的1%柠檬酸三钠溶液，继续加热；（3）待溶液变为亮红色或橙红色后，再继续加热搅拌；自然冷却至室温，即得。 

本发明通过实验发现，在胶体金的制备过程中，所加入的1%HAuCL₄溶液与1%柠檬酸三钠溶液的体积比对于胶体金包括粒径的大小、粒径的均一程度及有无凝集等性能有非常显著的影响；为了制备得到粒径均一、无凝集的胶体金，本发明考察了加入不同的1%柠檬酸三钠溶液的体积对于胶体金性能的影响；本发明非常意外的发现，当所加入的1%柠檬酸三钠溶液 的体积加入量为1.8mL时，粒径在20nm左右，透射电镜下观察，形状大都为圆形，大小基本相等，均匀一致，颗粒清亮透明，无凝集现象。多分散指数(PDI)为0.201(PDI表示体系中粒径的分散程度，数值越小表示体系中的颗粒粒度分布越集中)；当所加入的1%柠檬酸三钠溶液的体积用量为其它用量时，胶体金混浊或液体表面有漂浮物，有较多的凝集颗粒，有无椭圆形及多角形金颗粒存在。多分散指数(PDI)为0.201(PDI表示体系中粒径的分散程度，数值越小表示体系中的颗粒粒度分布越集中)。 

其中，步骤（1）或（2）中所述的继续加热时间优选为2min； 

步骤（3）中所述的继续加热搅拌的时间优选为15min。 

本发明还提供了一种用所所述的胶体金标记羊痘病毒P32单克隆抗体的金标抗体复合物；