[发明专利]一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及一种生产紫杉二烯的系统和微生物及其应用。

背景技术

1963年美国科学家首次从一种太平洋杉树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物，并发现其对鼠肿瘤细胞有很高活性。后来通过Ⅱ-Ⅲ期临床研究发现，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效，是现在最有潜能且商业应用最为成熟的一种抗癌药。现今获得紫杉醇的方法主要有三种：（1）最传统的从天然植物树皮中提取，（2）从植物叶片等组织中提取中间产物巴卡亭III等，随后通过化学合成生产紫杉醇，（3）利用植物组织培养后提取紫杉醇。这三种都是依赖于植物源的方式获得产物，因而价格一直很高，而且随着逐年的砍伐，可利用的红豆杉等植物已经越来越少，这很大程度的限制了利用该药物去治疗更多患者。

自从1993年，首次报道从太平洋红豆杉树木中分离到一株能独立生物合成产生紫杉醇的内生真菌以来，国内外就有大量的文献专注于解决紫杉醇的生物合成以及相关的紫杉烷类化合物这一问题。同时，另外一些科研工作者致力于阐明紫杉醇的合成途径，但目前仍有至少五步反应的功能基因还未克隆出来，在这些酶中，研究者一致认为催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成紫杉二烯的紫杉二烯合酶（Taxadiene synthase，TS）是合成紫杉二烯的第一个决定性步骤。

紫杉醇属于异戊二烯类超家族化合物，至今已报道有超过30000种被鉴定为异戊二烯类。而异戊二烯类超家族化合物都来源于相同的两个中间产物：异戊烯焦磷酸（IPP，isopentenyl diphosphate）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP，dimethylallyl diphosphate）。自然界中存在两个异戊二烯合成途径来提供IPP和DMAPP这两种通用的萜类化合物前体：（1）甲羟戊酸途径（MVA途径），主要存在于高等真核生物（动物，植物线粒体，真菌和酵母等）和部分细菌中，（2）非甲羟戊酸途径（DXP或MEP途径），主要存在于植物质体、原生生物和大多数细菌中，而链霉菌、部分植物等同时含有MVA和MEP途径。近年来，利用改造微生物內源的MEP或MVA途径，或者导入改造的外源MEP或MVA途径生产萜类化合物引起了人们的广泛兴趣。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生产紫杉二烯的系统。

本发明的另一目的在于提供一种生产紫杉二烯的微生物。

本发明的另一目的在于提供上述生产紫杉二烯的系统或微生物的应用。

本发明的再一目的还在于提供一种提高生产紫杉二烯能力的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种生产紫杉二烯的系统，包含甲羟戊酸途径和紫杉二烯合成相关基因或其功能等同体（同功能基因）中的一种或多种。所述的甲羟戊酸途径的相关基因包括（1）将乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A的基因atoB或其功能等同体、（2）将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA的基因erg13或其功能等同体、（3）将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的基因thmg1或其功能等同体、（4）将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因erg12或其功能等同体、（5）将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因erg8或其功能等同体、（6）将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯焦磷酸的基因mvd1或其功能等同体和（7）将异戊烯焦磷酸异构为二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi或其功能等同体；所述的紫杉二烯合成的相关基因包括（8）将异戊二烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸缩合为牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸的基因牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶ggpps基因或其功能等同体和（9）将牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸环化为紫杉二烯的紫杉二烯合酶ts基因或其功能等同体。

优选的，所述的甲羟戊酸途径相关基因或其功能共同体和紫杉二烯合成相关基因或其功能共同体被设置在同一个载体或相互不同的载体上。由此，可以进一步提高采用该系统转化微生物的效率。

所述的甲羟戊酸途径的相关基因优选为来源于大肠杆菌BL21（DE3）的atoB（CP001509.3:2216470-2217654）、idi（CP001509.3:2863926-2864474）和来源于酿酒酵母INVSC1的erg13（329138949:19060-20535）、thmg1（329138949:115734-117239）、erg12（329138949:684467-685798）、erg8（329138949:712316-713671）、mvd1（329138953:701895-703085）。