[发明专利]一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于白血病细胞株技术领域，具体涉及一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1及其制备方法。

背景技术

白血病细胞株在白血病的基础研究中具有重要的地位，采用细胞株在体外进行实验及动物模型的构建，不仅能从分子、基因水平深入研究肿瘤发生和发展机理，而且对临床的早期诊断、药物筛选和治疗具有重要意义。

目前国内外文献报道，并常用于白血病诊断及治疗研究的白血病细胞株包括：人早幼粒急性白血病细胞株HL-60、人慢性髓系白血病细胞株K562等。

人不典型慢性粒细胞性白血病（英文全称，简称aCML），为慢性白血病中的一种罕见类型，起病缓慢，早期多无明显症状，往往在体格检查或其他疾病就诊时偶然发现脾肿大或白细胞异常，早期诊断困难。目前临床也没有较佳的治疗方案，预后差，中位生存年龄仅14-25个月。骨髓细胞染色体核型异常可高达80%，最常见的是+8和del(20q)，20-40%的患者演变为急性白血病，其余患者常死于骨髓衰竭。到目前为止，对aCML的治疗经验很少，尚无满意的治疗方法。目前报道应用地西他滨治疗aCML，7例患者中有4例获得血液学改善，主要不良反应是重度骨髓抑制。

因此，筛选并获得稳定的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株，建立体外的aCML模型，将对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，本发明另一目的在于提供该人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法及其应用。

本发明的第一方面，是提供了一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明人从一名不典型慢性粒细胞性白血病（aCML）患者的骨髓中获得该白血病细胞株的原代细胞。

本发明应用体外细胞培养技术建立人髓系细胞株，采用细胞株作为实验对象，分析细胞的形态学、遗传学、免疫表型、裸鼠致瘤率等特点，为进一步研究aCML的发病机制及治疗提供有效且稳定的细胞模型。

本发明的第二方面，是提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法，该方法包括以下步骤：

1.原代培养：

抽取该患者骨髓1-5ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液加入10-30ml锥形离心管中，升至室温（18-25℃）；将离心管倾斜45°，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上1cm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心15-30分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10-20mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10-20min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入IMDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37℃，5﹪二氧化碳培养箱内。

2.传代：

将在IMDM完全培养基中的悬浮细胞，培养于培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代：在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，弃上清，加入IMDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入培养皿。

3.冻存和复苏

冻存：冻存前24小时更换新鲜的IMDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，加入含IMDM完全培养基，调整细胞浓度为1*10⁶～2*10⁶/ml，分装细胞悬液至EP管，每管为1ml细胞悬液，大约1*10⁶～2*10⁶个细胞数，再次离心，1500r/min，离心5-10分钟，弃上清，细胞沉淀加入1-3ml冻存液，吹打均匀，移入无菌冻存管，4℃30分钟，-20℃60分钟，-80℃过夜，次日移入液氮。