[发明专利]一种用磷酸盐扩增γδT细胞的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用磷酸盐扩增γδT细胞的方法及其应用。

背景技术

T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)的不同分为两类：TCRαβT细胞和TCRγδT细胞，分别简称为αβT细胞和γδT细胞。γδT细胞具有特异性识别抗原而无MHC限制性，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等功能，是机体免疫监视的第一道防线。如何高效、快速地在体外大量扩增人外周血γδT细胞，对于γδT细胞免疫功能的研究、提高病人免疫力、抵抗肿瘤和抗感染能力非常重要，但由于γδT细胞在外周血和肿瘤组织中含量不高，一般不超过T细胞总数的5％，要获得大量高细胞毒活性的γδT细胞是十分困难的。

授权公告号为CN1306027C的发明专利提供了一种体外扩增γδT淋巴细胞的方法，该方法采用固相抗γδTCR抗体选择性扩增γδT细胞，但是其使用的抗γδTCR抗体较贵，生产成本太高。

授权公告号为CN102533649B的发明专利提供了一种简单高效制备人γδT细胞的方法，该方法采用结核杆菌耐热性抗原联合细胞因子人重组rhIL-2及人重组rhIL-21刺激扩增γδT细胞，但该法获得的γδT细胞的特异性克隆占优势，但普适性较差，不能广泛杀伤不同类型的肿瘤。

因此有必要提供一种高效、低成本的对肿瘤具有广泛杀伤能力的γδT细胞的制备方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法，该体外扩增人γδT细胞的方法采用(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2刺激单个核细胞，从而扩增其中的γδT细胞；该方法成本低、操作流程简单、且能在较短时间内获得具有广泛杀伤性的γδT细胞；本发明还提供了该体外扩增人γδT细胞的方法的应用。

本发明所述“γδT细胞”是指T淋巴细胞受体（TCR）由γ和δ链构成的淋巴细胞；本发明所述“单个核细胞”是指以淋巴细胞为主的细胞群体，其中含有少量的单核细胞。

第一方面，本发明提供了一种体外扩增人γδT细胞的方法，包括如下步骤：（1）制备或提供单个核细胞；（2）将单个核细胞加入细胞培养液中，置于细胞培养箱中培养，以及（3）收获培养后的细胞，所述细胞培养液中含有(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐以及人重组白细胞介素rhIL-2。

优选地，所述细胞培养箱的条件设置为37℃，5%CO₂。

优选地，所述(1-羟基-3-(甲基戊基氨基)丙叉)二膦酸单钠盐（IBA）在细胞培养液中的摩尔浓度为0.5μM～2.0μM。

优选地，所述人重组白细胞介素rhIL-2在细胞培养液中的浓度为10～100U/ml。

本发明提供的细胞培养液中rhIL-2的浓度为10～100U/ml是本发明的优选范围，根据需要，可以适当加大rhIL-2在细胞培养基中的浓度，比如采用含100～500U/ml的rhIL-2的细胞培养液。

在本发明技术方案的细胞培养液中选用人重组白细胞介素rhIL-2。其他来源的IL-2（比如直接从动物体内提取的IL-2）可做为人重组白细胞介素rhIL-2的替代品，但用来扩增人γδT细胞可能会引起免疫反应，是较差效果的选择。

优选地，所述树突状细胞与所述单个核细胞的摩尔比为1:5～20。

进一步优选地，所述树突状细胞为所述单个核细胞的0.1倍。

优选地，所述细胞培养的过程中，每2～3天进行半量更换培养液。

优选地，所述细胞培养的时间为8～14天。

进一步优选地，所述细胞培养的时间为8天。

优选地，所述单个核细胞来源于人的外周血。

优选地，所述细胞培养液为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗。其中，RPMI-1640购自gilco公司，FBS为牛胎血清，双抗为链霉素和青霉素。

优选地，所述细胞培养液中含有10%～15%的牛胎血清（FBS）或10%～15%的人血清。

进一步优选地，所述细胞培养液中含有10%的牛胎血清（FBS）或10%的人血清。

本发明采用含10%～15%FBS的培养细胞液是本发明的优选范围，此外，可以根据需要调整细胞培养液中血清的浓度，比如培养液采用15%以上的血清浓度。

可选地，人血清为分离PBMC所收集的血清，该血清需要56℃灭活30min以去除血清中补体等对热敏感的物质。