[发明专利]决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法

权利要求书

1.决明SoICS基因，其特征在于：该基因核苷酸序列为SEQID NO：1。

2.根据权利要求1所述决明SoICS基因，其特征在于：所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQID NO：2。

3.用于克隆决明SoICS基因的引物组，其特征在于：所述引物组序列如下：

ICS3-1              5′-GTTTGTGGG(T/C)TTCCA(A/G)CAGAAG-3′

GeneRacer 3′P      5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′

ICS3-2              5′-TATGC(T/G)GGGACAGGGATAGT-3′

GeneRacer 3′NP     5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

ICS5-1              5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA-3′

Clontech UPM        5′-GAGCAACTTGGTGAACTGAG-3′

ICS5-2              5′-GAGTTCTAGCTCATCCCACTC-3′

Clontech NUP        5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

FsoICS3S            5′-ATGGCAACCGGAGCTGCACACA-3′

RsoICS3S            5′-ATTGATGGTGCTCAATGCTCATATACAGTC-3′。

4.一种克隆决明SoICS基因的方法，其特征在于：包括如下步骤

步骤一、决明总RNA提取和反转录；

步骤二、3′-RACE和5′-RACE扩增；

步骤三、决明ICS基因全长cDNA序列扩增；

步骤四、PCR产物的克隆纯化与筛选。

5.根据权利要求4所述的克隆决明SoICS基因的方法，其特征在于：所述步骤二中3′-RACE和5′-RACE扩增包括如下步骤：

A、决明ICS基因cDNA的3′末端一扩反应

使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacer Kit提供的GeneRacer3′P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进行3′末端一扩反应；扩增体系为ddH2O17.25μl，10×buffer2.5μl，dNTP(10mmol L-1)0.5μl，MgCl2（25mmol L-1）1.5μl，3′P（10μmol L-1）0.5μl,ICS3-1(10μmol L-1)0.5μl，总cDNA0.5μl，Taq聚合酶（5Uμl-1）0.25μl，总体积25μl；扩增程序为：94℃2min，94℃1min，56℃1min，72℃1min，35个循环，72℃延伸10min；

B、决明ICS基因cDNA的3′末端巢扩反应

使用基因特异引物ICS3-2和GeneRacer Kit提供的物GeneRacer3′NP为引物对，以0.5μl3′-RACE一扩产物作为模板，进行决明ICS基因的3′末端巢扩反应，反应体系和扩增程序同一扩；

C、决明ICS基因cDNA的5′末端一扩反应

使用5′RACE基因特异引物ICS5-1与SMARTTMRACE试剂盒提供的引物ClontechUPM为引物对，用总cDNA为模板，进行5′端一扩反应，扩增体系为ddH2O17.25μl，10×buffer2.5μl，dNTP（10mmol L-1）0.5μl，MgCl2（25mmol L-1）1.5μl，UMP（10μmol L-1）0.5μl,ICS5-1(10μmol L-1)0.5μl，3′RACE cDNA0.5μl，Taq酶（5Uμl-1）0.25μl，总体积25μl；扩增程序为：94℃2min，94℃1min，57℃1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min；

D、决明ICS基因cDNA的5′末端巢扩反应

使用5′RACE的基因特异引物ICS5-2与SMARTTMRACE试剂盒提供的3′末端巢扩引物ClontechNUP为引物对，以0.5μl一扩产物作为模板，进行决明ICS基因的5′末端巢扩反应，反应体系和PCR扩增程序同一扩。