[发明专利]单核淋巴细胞体内示踪方法

权利要求书

1.一种单核淋巴细胞体内示踪方法，其特征在于，包括以下步骤：

采集食蟹猴腋窝处的淋巴结；

利用密度梯度离心法获取所述淋巴结中的单核淋巴细胞；

将所述单核淋巴细胞进行荧光染色；

将所述染色后的单核淋巴细胞输注至所述食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中；

再次采集与所述输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结，并对再次采集的淋巴结采用流式细胞仪进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光染色中采用的染料为羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采集食蟹猴腋窝处的淋巴结的步骤包括：

麻醉食蟹猴：使用氯胺酮15mg/kg进行麻醉；麻醉后将食蟹猴仰卧保定，将其腋窝局部、四肢局部剃毛以暴露手术部位和静脉，所述静脉用于麻醉保定后补液，补液为5％葡萄糖氯化钠，所述补液注射速度为1mL/min；

采集淋巴结：以碘伏消毒所述手术部位，医用酒精脱碘；从食蟹猴腋中线剪开一小口，分离浅筋膜，暴露其深层的结缔组织、脂肪组织及淋巴结，取出淋巴结。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用密度梯度离心法获取所述淋巴结中的单核淋巴细胞的步骤包括：

200目不锈钢网研磨所述淋巴结，并利用磷酸盐缓冲液、Hank′s液或RPMI1640制备淋巴细胞悬液；

在所述悬液中加入红细胞裂解液以裂解悬液中的红细胞；

将所述红细胞裂解后的悬液缓慢加入葡聚糖-泛影葡胺液面上，水平离心2000rpm×20min；

吸取离心后云雾层的液体，置于一短中管中，并加入5倍以上体积的磷酸盐缓冲液、Hank′s液或RPMI1640；

1500rpm×10min洗涤重悬离心3次，获得单核淋巴细胞。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将单核淋巴细胞进行荧光染色的步骤包括：

将500ugCFSE和90uL二甲基亚枫混合以制备10mmol/L的CFSE母液；

利用磷酸盐缓冲液将所述CFSE母液稀释至2umol/L；

取100ml稀释后的CFSE母液与100ml单核淋巴细胞悬液混合染色，获得1umol/L的CFSE荧光单核淋巴细胞悬液，其中，所述染色孵育温度为37℃，时间为15～20min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述将染色后的单核淋巴细胞输注至所述食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中的步骤包括：将所述CFSE荧光单核淋巴细胞悬液输注至所述食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中；

其中，所述CFSE荧光单核淋巴细胞悬液输注至所述食蟹猴内的体积为0.5ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述再次采集与所述输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结，并对再次采集的淋巴结采用流式细胞仪进行检测的步骤包括：

输注所述CFSE荧光单核淋巴细胞后1h、2h、3h、4h分别采集与所述输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结；

采用步骤利用密度梯度离心法获取所述淋巴结中的单核淋巴细胞的方法获取荧光单核淋巴细胞；

将所述获取的荧光单核淋巴细胞通过流式细胞仪进行检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述利用密度梯度离心法获取所述淋巴结中的单核淋巴细胞的步骤之后包括：

将所述单核淋巴细胞重悬；

取所述悬液与台盼兰染液混合，加至细胞计数板上，计算细胞个数。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将单核淋巴细胞进行荧光染色的步骤之后包括：

取CFSE荧光单核淋巴细胞悬液与台盼蓝溶液混合，加至细胞计数板，计数活细胞和死细胞的数量。