[发明专利]一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法

说明书

技术领域

 本发明属于疫苗制备技术领域，涉及一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法。

背景技术

猪瘟(classical swine fever, CSF)，是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病。1984年世界动物卫生组织(OIE) 将其列入A类传染病，我国目前也将其定为一类传染病。猪瘟除可引起败血症以外，还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗、淋巴细胞和血小板减少等。目前，世界大部分国家都采取了严格的卫生防疫措施和剔除猪瘟感染猪净化猪群来控制和消灭猪瘟，一些发达国家通过防疫和防控手段已经彻底根除了猪瘟。所以，免疫接种是猪瘟防控的重要措施，而且对无猪瘟国家爆发猪瘟时根除本病和阻止野毒传向无猪瘟猪群也很有必要。因此，各国学者一直没有放弃对猪瘟疫苗的研制和开发。

至今为止，猪瘟疫苗在研发及临床应用上主要有猪瘟灭活苗、猪瘟弱毒苗、猪瘟基因工程疫苗、猪瘟标记疫苗、以及猪瘟DNA疫苗等几类。其中猪瘟灭活苗是在上世纪中页由Dorest等首先利用结晶紫制备的，但由于其低免疫原性、低保护力等因素已退出市场。猪瘟弱毒苗主要有兔弱化苗及低温细胞苗，两种疫苗都是由弱毒制备，是目前市场上主要应用的产品。猪瘟基因工程苗主要有由Hulst、Bouma、及 Tsibezov等分别制备的亚单位疫苗；以及由Dong等制备的多肽疫；还包括Rumenapf、Konig、Peeter等分别制备的活病毒载体疫苗，但都由于免疫源性或安全性等因素没有取得良好的实用效果，甚至没有上市应用。猪瘟标记疫苗的本质仍是亚单位疫苗，是在研发时去掉保护性抗原的某一表位，在临床应用后，可根据动物体所产生的特异性抗体种类而区分动物是自然感染还是经过免疫。标记疫苗从上世纪末期至今都有报道，虽然有着较好的安全性及临床应用的便捷，但由于免疫源性等原因，目前还没有较好的产品问世。而DNA疫苗作为疫苗研发领域内的一个重要部分，每年都有针对各种病原体的DNA疫苗的报道，但是由于DNA疫苗涉及转基因问题，在全世界对转基因问题的看法不会改变时，DNA疫苗仍无法实际应用。

综上所述，目前市场上所应用的猪瘟疫苗仍旧以兔弱化苗及由细胞培养而来的细胞苗为主。其中我国主要应用的兔弱化苗是1954年成功培育出并制成疫苗的CLS株病毒，也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织 ，该毒株虽然可以通过怀孕猪的胎盘屏障，但不感染胎儿引起任何畸变，同时毒力不返强，对乳猪和种猪无残余毒性。而细胞苗主要应用毒株有GPE株及Thiverval株，此弱毒株都是由强毒株在猪睾丸或猪肾细胞上通过传代，随后用终点稀释法选出纯系毒株，再通过牛睾丸细胞及豚鼠肾细胞传代，最终筛选出纯系毒株，该毒株能很好的在30℃温度中增殖。在生产及应用上与兔弱化苗相比，细胞苗是用细胞培养，都是以种子批系统为基础，每批种子在同一性、无菌性、纯度、安全性、非传染性、稳定性和免疫原性等方面都是一致的，以确保同批疫苗的均一性。但在疫苗生产过程中动物血清的使用会产生成本增加、引入外源蛋白、引入其他病毒及病原体的风险，是细胞苗在生产过程种面临的一个棘手问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无血清培养猪睾丸细胞及利用其生产猪瘟细胞疫苗的方法，无血清驯化培养得到的猪睾丸细胞，可较好的使猪瘟病毒增殖并应用于猪瘟细胞疫苗生产，并且避免动物血清的使用带来的风险。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种无血清培养猪睾丸细胞的方法，包括以下步骤：

1）将猪睾丸细胞用含10%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含5%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含10%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 

2）当细胞贴壁后，更换含5%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含2%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含5%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 

3）当细胞贴壁后，更换含2%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换含1%小牛血清的培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含2%小牛血清的培养基传代培养3-5代； 

4）当细胞贴壁后，更换含1%小牛血清的培养基进行培养，当细胞生长至60%时更换无血清培养基进行适应培养并且当有细胞死亡并悬浮时更换新鲜培养基，当细胞长满时用含1%小牛血清的培养基传代培养3-5代；