[发明专利]去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种去亲和层析纯化标签的基因重组七鳃鳗Lj-RGD3 蛋白的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接，转化入表达菌后进行阳性转化子的筛选鉴定；

b. 对阳性重组子进行IPTG诱导表达；

c. 对表达的重组蛋白进行提取；

d. 对提取的蛋白依次按如下步骤进行纯化：

d-1．通过金属螯合离子亲和层析柱HiTrap IMAC HP进行蛋白纯化：

将HiTrap IMAC HP柱连接到已经用20％乙醇冲洗好的BIO-RAD仪器上，用10倍柱体积的蒸馏水对柱子进行润洗，润洗的过程中保持UV值稳定，初始值为0；用2.5倍柱体积的0.1M浓度的硫酸铜溶液走柱，再用10倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子；用10倍柱体积的 Binding buffer平衡柱子，保持柱子UV值稳定，UV基线值为0；将提取的蛋白过柱，之后再用15倍柱体积的Binding buffer平衡柱子，再用Elution buffer洗脱目的蛋白，流速为1ml/min；收集洗脱液为1ml/管，回收第42~54管的样品，保存于-20℃；所述的Binding buffer溶液成分由20mM 磷酸钠、0.5M氯化钠、5mM咪唑组成；所用的Elution buffer溶液成分由 20mM 磷酸钠、0.5M氯化钠、500mM咪唑组成；

d-2．对所收集的蛋白采用SP柱进行阳离子交换层析：

将阳离子交换柱SP柱连接到BIO-RAD仪器中，用灭菌水清洗柱子，流速为1ml/min，洗10个柱体积；用10倍柱体积的低盐缓冲液平衡柱子，流速为1ml/min，直至UV基线保持在稳定的水平上，初始值为0；将已收集的蛋白过SP柱，再用10倍柱体积的高盐缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1ml/min；收集洗脱液为1ml/管，回收第26~34管的样品保存于-20℃；所用的低盐缓冲液成分由 50mM Tris-HCl和50mM NaCl 组成，所用的高盐缓冲液成分由50mM Tris-HCl和1M NaCl组成； 

d-3.透析：

采用截留分子量为10 kDa的透析袋对上述经步骤d-2纯化的蛋白进行4℃过夜透析，透析缓冲液为去离子水；

d-4. 冷冻干燥：

将经步骤d-3透析的蛋白经冷冻干燥，制备rLj-RGD3（Tag-）蛋白冻干粉。

2.根据权利要求1所述的去亲和层析纯化标签的七鳃鳗rLj-RGD3 Tag^-基因重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述a步骤的在Lj-RGD3基因序列3’末端引入终止密码子，与载体以Nde I和Hind III酶切位点相连接的引物序列为：

P1： 5’-XXcatatgtcaacgttcatcaacggaacc-3’

P2： 5’-XXaagctttcactccccaacacattcact-3’。