[发明专利]抑制肥大细胞钙通道的适配子及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种抑制肥大细胞钙通道的适配子及其制备方法。

背景技术

2006年，Feske等人首先识别出一种新蛋白，命名为Orai1，并且提出Orai1蛋白是钙离子释放激活通道（Ca²⁺release activation channel，CRAC）的基本组成部分。随着研究的逐步深入，现在已经明确Orai1是一个广泛表达的细胞膜表面蛋白，分子大小约为33kD，具有四个跨膜区域，两个膜外区，N端和C端位于细胞内。研究发现将编码Orai1第1膜外区D110和D112位的带负电荷的天冬氨酸密码子突变为编码中性的甘氨酸密码子，突变体cDNA转染HEK293细胞，可使Orai1丧失对钙离子的通道功能。

20世纪90年代，一种制备特异性寡核苷酸分子的SELEX技术问世，寡核苷酸分子被称为适配子(aptamer)。适配子可以是ssDNA、dsDNA或RNA，是从随机的DNA或RNA寡核苷酸库中，经过多个循环的筛选和富集而获得的。它们的特点是能形成一定的立体结构，通过空间构象与靶分子高特异性、高亲和力地结合。适配子最大的优点是没有免疫原性，故在临床治疗时能重复使用。治疗人类眼部黄斑病变的适配子药物Macugen，已经在美国批准上市。目前该技术在医学及生命科学的各个领域都展现了广阔的应用前景。

I型超敏反应是指机体受到某些抗原刺激时，引起的由特异性IgE抗体介导产生的一种发生快消退亦快的免疫应答，表现为局部或全身的生理功能紊乱。具有明显个体差异和遗传倾向。而I型超敏反应的关键环节是激活肥大细胞，活化的主要标志是脱颗粒反应。无论有无IgE和IgE受体参与，Ca²⁺从细胞外经CRAC通道迅速进入细胞内是有效激活肥大细胞、产生脱颗粒反应的充分和必要条件。因此，通过抑制肥大细胞的钙离子通道以缓解和治疗I型超敏反应成为一种新的选择。但是，目前还没有能够有效的抑制肥大细胞的钙离子通道的手段。

发明内容

针对上述需要，本发明为进一步实现通过抑制肥大细胞的钙通道以缓解和治疗I型超敏反应提供了一组抑制肥大细胞钙通道的适配子。

本发明提供的抑制肥大细胞钙通道的适配子具有如SEQ ID NO5-11所示的核苷酸序列，该适配子的二级结构为茎环或口袋结构并且能够与orail蛋白特异性结合。

本发明还进一步提供了该抑制肥大细胞钙通道的适配子的制备方法，具体包含以下步骤：

1）构建长度为80nt的随机ssDNA文库，其中，所述随机ssDNA文库的两端为固定序列，中间含39个随机碱基序列；

2）设计针对固定序列的上下游引物，并制备ssDNA次级文库；

3）取所述ssDNA次级文库进行多于3轮的SELEX筛选得到与orail蛋白高亲和性结合的适配子-靶物质复合物；

4）将步骤3）所述的适配子-靶物质复合物与orail蛋白分离纯化即得到纯化的适配子。

优选地，步骤1）所述随机ssDNA文库两端的固定序列为5’-CTT CTG CCC GCC TCC TTC C-(39N)-GGA GAC GAG ATA GGC GGA CAC T-3’。

优选地，步骤2）所述的上游引物P1和下游引物P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。

优选地，步骤2）所述制备ssDNA次级文库的方法为直接不对称PCR法，其中，所述上游引物P1和下游引物P2的比例关系为1：50或1：100。

优选地，步骤3）所述SELEX筛选的轮次数为12轮。

优选地，步骤4）中将所述适配子从所述适配子-靶物质复合物中分离纯化的方法为聚苯乙烯微孔板法。

本发明还进一步提供了该抑制肥大细胞钙通道的适配子在缓解或治疗I型超敏反应中的应用。

过敏反应的关键环节是激活肥大细胞，活化的主要标志是脱颗粒反应。无论有无IgE和IgE受体参与，Ca²⁺从细胞外经CRAC通道迅速进入细胞内是有效激活肥大细胞、产生脱颗粒反应的充分和必要条件。人的Orai1蛋白分子共有5个带负电荷的氨基酸，2个为谷氨酸残基分别位于第1和第3跨膜区，3个天冬氨酸残基均位于第1膜外区。研究发现分别构建编码这几个氨基酸残基的突变cDNA转染入HEK293细胞，给予钙池激动剂，钙内流和膜电流受到明显抑制，说明这几个带负电荷的氨基酸对钙离子的入胞具有决定性的作用。