[发明专利]肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列及其蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种肿瘤坏死因子α因子蛋白的全序列，其特征在于：具有序列表中SEQ ID NO.1所示的来自于池蝶蚌体内的LITAF蛋白的核酸全序列和具有序列表中SEQ ID NO.2所示的来自于池蝶蚌体内的LITAF蛋白的氨基酸序列。

2.一种如权利要求1所述的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

提取池蝶蚌的总RNA，反转录得到cDNA，以该cDNA为模板，将设计好扩增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段，进行聚合酶链式反应，得到编码LITAF蛋白的基因全序列；再通过构建重组表达载体pET-32c(+)-LITAF，体外诱导LITAF蛋白表达；最后分离纯化目的蛋白，获得重组的LITAF蛋白，所制备得到的蛋白具有序列表中SEQ ID NO.1所示的来自于池蝶蚌体内特有的LITAF蛋白的核酸全序列及SEQ ID NO.2所示的来自于池蝶蚌体内特有的LITAF蛋白的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的肿瘤坏死因子蛋白的制备方法，其特征在于所述步骤具体为：

1）以池蝶蚌的cDNA为模板，设计扩增LITAF蛋白基因的引物，将设计好扩增LITAF蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段，进行嵌套聚合酶链式PCR反应，得到编码LITAF蛋白的基因全序列；

2）利用基因重组技术将LITAF基因片段克隆到合适的pMD19-T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-32c(+)原核表达载体相连接，获得表达重组载体pET-32c(+)-LITAF；利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-32c(+)-LITAF；

3）取阳性重组质粒pET-32c(+)-LITAF，体外诱导LITAF蛋白表达，利用Western-blot和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定目的蛋白；

4）用亲和层析法分离纯化目的蛋白，获得重组的LITAF蛋白。