[发明专利]一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种花生青枯病菌巢式PCR检测方法。

背景技术

花生青枯病是由Ralstonia solanacearu引起的一种细菌性维管束病害。该病害于1905年在印度尼西亚首次报道，随后在20多个国家和地区相继发生或出现报道。目前，主要以中国、印度尼西亚和越南危害较重。我国关于花生青枯病的报道始见于30年代后期，现在主要分布于中部和南方地区，每年全国实际病地面积在40万hm²以上，受危害程度居世界首位。花生青枯病发病率一般在10%－30%左右，减产20%以上；重病区发病率可在50%以上，甚至导致完全绝收。近年来有报道显示，花生青枯病表现出向北蔓延的趋势，给花生生产带来更大威胁。除引起减产外，青枯病的发生还会降低花生品质，并增加黄曲霉毒素的污染。同时，花生青枯病是一种土传病害，可经雨水、土壤、病残体等从发病区向未发病区传播，且其侵染能力强，在较短的时间内可造成植株枯萎死亡。随着设施农业的高度集约化生产，复种指数高，品种单一，导致该类病害的发生越来越严重。因此，开展花生青枯病菌的快速检测，对该病害的早期诊断和及时防治具有十分重要的意义。

目前，关于花生青枯病菌的检测方法包括传统分离培养法、血清学和分子生物学等方法。青枯病菌的传统分离培养法是采用选择性培养基对病原物进行分离纯化，然后进行一系列的生理生化实验进行诊断，该方法易受外界因素的影响且灵敏度较低。而应用血清学方法时血清的制备过程耗时耗力，且可能存在交叉反应，造成检测结果的假阳性。基于PCR原理的分子生物学技术是一种灵敏度高、特异性强的快速检测技术，已在多种植物病害的检测中得到广泛应用。在细菌基因组中，16S-23S rDNA ITS序列在物种进化过程中具有高度的保守性，目前很多病原细菌分子检测方法的建立都是基于这一位点。本发明通过比较花生青枯病菌和同属近缘种的16S-23S rDNA ITS序列选择差异位点设计特异引物，采用巢式PCR对花生青枯病菌进行检测，灵敏度高，特异性强，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其具有特异性强、灵敏度高的特点，可用于田间花生青枯病的早期诊断，对花生青枯病菌引起病害显症之前的早期监测和及时防治具有十分重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种花生青枯病菌的巢式PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）、基因组DNA提取：采用CTAB法提取花生青枯病菌基因组DNA或发病植物组织DNA；

步骤2）、第一轮PCR扩增：以步骤1）得到的DNA样品为模板，采用细菌16S-23S rDNA ITS序列通用引物L1/L2经PCR扩增得到第一轮PCR产物；

引物序列：L1：5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’（SEQ ID NO:1）；

          L2：5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’（SEQ ID NO:2）；

PCR反应体系25μl：DNA模板 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液 2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶 0.5μl，10μ mol/L的L1引物1μl，10μ mol/L的L2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；

PCR扩增程序：95℃预变性4min，94℃变性1 min，60℃退火30 sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；

步骤3）、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液为模板，采用花生青枯病菌特异引物W1/W2经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；

引物序列：W1：5’-TCCTACCAGACCCACCAAG TTACGG-3’（SEQ ID NO:3）；

          W2：5’-GTATGTCTCGCTATAGGCTGAGTTC-3’（SEQ ID NO:4）；

PCR反应体系25μl：第一轮PCR扩增产物或扩增产物的稀释液 1μl，10×PCR反应缓冲液 2.5μl，2.5 mmol/L dNTPs混合液2μl，5U/μl DNA Taq聚合酶0.5μl，10μ mol/L的W1引物1μl，10μ mol/L的W2引物1μl，灭菌超纯水补足至25μl；