[发明专利]食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法和检测试剂盒

权利要求书

1.一种食用油中转基因成分CaMV35S的恒温检测方法，包括如下步骤：

1）根据CaMV35S启动子基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；

2）提取待检样品DNA；

3）待检样品DNA在上述引物、Bst DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；

4）根据扩增结果判断待检样品中是否存在CaMV35S转基因成分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：  CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）提取待检样品DNA的具体步骤为：

1）取一定样品油，加入1～3倍体积的正己烷和0.1～0.3倍体积的TE，20～25℃环境条件下，混合均匀；

2）静置分层后，去除上层油相；

3）将下层的TE水相转移到离心管；依次加入1～2 μg 鲑鱼精DNA，0.5～0.7倍体积预冷的异丙醇，0.1～0.2倍体积的3 mol/L的乙酸钠；轻轻来回颠倒混匀后置于－20℃以下沉淀DNA；

4）沉淀过夜后离心，弃上清液，用预冷的65～75%的乙醇洗涤沉淀，转移到离心管，离心；

5）空干DNA，加入TE溶解DNA，置于－20℃以下保存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述恒温扩增反应的体系为：25 μL LAMP 反应体系含有1.6 μmol/L 35S-FIP、1.6 μmol/L 35S-BIP、0.2 μmol/L 35S-F3、0.2 μmol/L 35S-B3、0.8 μmol/L 35S-FLP、0.8 μmol/L 35S-BLP、1 mol/L甜菜碱、8 mmol/L MgSO4、8 U Bst DNA聚合酶、1.6 mmol/L dNTP、2.5 μL 10×Thermo pol Buffer 及待测DNA模板2 μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述恒温扩增反应的程序为：60～65℃恒温反应45～60min。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，步骤4）可根据恒温荧光法判断检测结果，在反应体系中加入2-20 μM SYTO-9，使用荧光PCR仪（如ABI7500）或其它恒温荧光检测仪(Genie Ⅱ)进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“s”型扩增曲线的为阳性，无“s”型扩增曲线的为阴性。

7.一种用于检测食用油中转基因成分CaMV35S的试剂盒，其包括6条根据CaMV35S启动子基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：

35S- F3：GGTGGCTCCTACAAATGC（SEQ ID NO:1），

35S- B3：GTCTTGCGAAGGATAGTGG（SEQ ID NO:2），

35S-FIP：GTCCATCTTTGGGACCACTGTCCATCATTGCGATAAAGGAAAGG（SEQ ID NO:3），

35S-BIP：  CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC（SEQ ID NO:4），

35S-FLP：AGAGGCATCTTCAACGATGG（SEQ ID NO:5），

35S-BLP：AGAAGACGTTCCAACCACG（SEQ ID NO:6）。