[发明专利]红花制剂中过敏原的检测方法

权利要求书

1.一种检测红花制剂中过敏原的方法，该方法包括以下步骤：

⑴提取红花花粉总蛋白；

⑵将步骤⑴得到的红花花粉总蛋白对鼠进行免疫，制备单克隆抗体；

⑶用步骤⑵得到的单克隆抗体以间接ELISA法对红花制剂进行过敏原的检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取红花花粉总蛋白的方法为水提醇沉法，得到的沉淀即为总蛋白。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的水提醇沉法为：取红花花粉加入到至少3倍量（v/w）的水中，50-80℃提取至少1小时，过滤，滤液加至少1倍量（v/v）的乙醇，低于室温下放置至沉淀完全，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的水提醇沉法为：取适量的红花花粉加入到3-10倍量（v/w）的水中，50-80℃提取1-4小时，过滤，取滤液加1～3倍量（v/v）的乙醇，2～8℃放置15～20小时，弃去上清液，得到的沉淀即为红花花粉总蛋白。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法得到的沉淀为红花花粉总蛋白，该总蛋白得率为0.05～0.2‰，以Bradford法检测蛋白的含量为0.08～3mg/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤⑵是将红花花粉总蛋白对小鼠进行免疫，分为初次免疫、加强免疫和冲击免疫；其中的初次免疫为，按蛋白量60-100μg/只，配合0.1-0.2ml完全弗氏佐剂，背部皮下多点注射免疫；加强免疫分为三次，首次加强免疫在初次免疫后7-20天进行，蛋白量为20-60μg/只，配合0.1-0.2ml不完全弗氏佐剂；后两次加强免疫与初次免疫相同，时间间隔为5-15天；冲击免疫按蛋白量20-80μg/只，采用脾内免疫方式于第三次加强免疫后5-15天进行。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的制备单克隆抗体的方法为：取小鼠冲击免疫后2～5天的脾细胞，将该脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出阳性细胞并对其进行克隆。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的制备单克隆抗体的方法为：取小鼠冲击免疫后3～4天的脾细胞，采用PEG常规融合方法，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合；采用间接酶联免疫吸附实验方法对融合细胞上清液进行筛选，确认阳性细胞后采用有限稀释法对阳性细胞进行克隆。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括对步骤⑵得到的单克隆抗体进行纯化的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体进行纯化的方法为：先以体内诱生法制备含大量单克隆抗体的腹水，将该腹水加到由pH值7.0～7.4的10～30mM/L磷酸盐缓冲液平衡后的Protein G亲和柱上，收集流出液，将该流出液再次上柱，继续平衡至基线平稳；再以pH值为2.0～3.0的0.05～0.2M/L甘氨酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱峰用pH值7.0～7.4的10～30mM/L磷酸盐缓冲液透析，得到纯化后的单克隆抗体。