[发明专利]一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂的制备方法

权利要求书

1.一种抑制土传病害秸秆腐熟剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，构巢曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先制备PDA培养液，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min既得；

将构巢曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度为25℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为30～100％，170rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；构巢曲霉的发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，最后采用真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得构巢曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤二，米曲霉固体吸附菌剂的制备，

首先PDA培养液配制，以配制1L培养基计，用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，用纱布过滤后，滤液加20g普通蔗糖，定容至1000ml，121℃灭菌20min，既得；

将米曲霉接种到PDA培养液中，进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：培养温度28℃，溶氧，所述溶氧的通气量范围为40～90％，120-180rpm，发酵中后期形成菌丝片段，发酵液菌株的菌落形成单位≥1×10⁷cfu ml^-1；米曲霉发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得米曲霉固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤三，枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先液体种子培养基和液体发酵培养基，所述液体种子培养基和液体发酵培养基为相同的培养基，均采用牛肉膏蛋白胨培养基，配方为，以配置1L培养基计：采用牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g，自来水1000ml，混合，121℃灭菌20min既得；

将枯草芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，所述的培养条件为：培养温度37℃，摇床转速150rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，制得种子；

将种子按照5％比例接种到液体发酵培养基进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～37℃，溶氧通气量范围为30～100％，150-220rpm，发酵后期发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1；枯草芽孢杆菌发酵液按照50％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤四，酵母菌固体吸附菌剂的制备

首先液体的种子培养基和发酵培养基采用豆芽汁培养基为相同的培养基，其配方为，以1L培养基计：称新鲜黄豆芽100g，葡萄糖35g，加入1000ml水，混合后煮沸30min，纱布过滤，滤液加35g葡萄糖，115℃灭菌30min，既得；

将酵母菌接种到豆芽汁种子培养基培养，培养条件为：培养温度30℃，摇床转速130～160rpm，培养时间36小时，种子含菌量大于1×10⁸cfu ml^-1，种子按照8％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH自然，培养温度28～32℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～190rpm，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁸cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；酵母菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，制得酵母菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤五，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂的制备

首先液体种子培养基和发酵培养基，所述发酵培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基为相同的培养基，其配方为，以1L培养基计：将牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl10g和自来水1000ml混合，于121℃灭菌20min既得；

将短小芽孢杆菌接种到液体种子培养基培养，培养条件为：培养温度37℃，摇床转速130～160rpm，培养时间24小时，种子含菌量大于1×10⁹cfu ml^-1，种子按照7％比例接种到发酵罐进行液体发酵生产，其发酵生产的条件为：初始pH范围为7.0～7.5，培养温度28～35℃，溶氧通气量范围为30～100％，120～160rpm，发酵后期部分菌株形成芽孢，发酵液该菌株的菌落形成单位≥1×10⁹cfu ml^-1，发酵液浓度变稠；短小芽孢杆菌发酵液按照40％(v：w)加入麦麸，真空干燥机干燥至含水量低于5％，粉碎机粉碎成菌种粉，短小芽孢杆菌固体吸附菌剂，低温保存备用；

步骤六

将构巢曲霉固体吸附菌剂、米曲霉固体吸附菌剂、枯草芽孢杆菌固体吸附菌剂、酵母菌固体吸附菌剂和短小芽孢杆菌固体吸附菌剂按照质量比1：1.5：1：1.5：2在无菌条件下复合搅拌，在无菌条件下包装，成品即为一种能够抑制土传病害的秸秆腐熟剂。