[发明专利]一种重组载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）是T淋巴细胞表面的受体，是抑制T细胞活化的共刺激分子，当T细胞表面受体CTLA4与APC上的B7分子结合后，会抑制T细胞的活化，从而抑制T细胞的过度活化。很多过度免疫反应引发的疾病均与CTLA4蛋白的低表达有着极为密切的关系，如同种异体移植引发的免疫排斥反应、慢性支气管哮喘、风湿性关节炎（RA）、艾滋病、系统性红斑狼疮、银屑病、内毒素性休克病等疾病，因此CTLA4蛋白或融合蛋白在这些疾病的特异性治疗方面有着十分广阔的应用前景。此外，CTLA4蛋白在机体内的过度表达与很多疾病特别是肿瘤有着密切的关系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和食道癌、利什曼病等。CTLA4的单克隆抗体CTLA4mAb可广泛用于抗肿瘤的免疫治疗，是目前肿瘤基因治疗的研究热点及方向。获得具有生物学功能、接近人类天然CTLA4蛋白的重组蛋白是CTLA4特异性治疗疾病的关键。

因此，有必要提供一种在真核细胞中表达CTLA4重组蛋白的表达载体。

发明内容

为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种重组载体，所述重组载体为酵母分泌表达载体pPICZaA的重组载体，该重组载体含有人源CTLA4胞外区基因，可用于表达人源CTLA4融合蛋白。该重组载体还含有Kex2蛋白酶酶切位点、His标签和c-myc标签，可使得表达的CTLA4融合蛋白以分泌蛋白的形式释放到胞外，并对蛋白进行纯化，为CTLA4蛋白的工业化生产提供了一种简便的方法。本发明第二方面提供了一种重组菌，该重组菌包含第一方面所述的重组载体。本发明第三方面提供了一种重组载体的制备方法。本发明第四方面提供了一种基因，所述基因是核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA分子。本发明第五方面提供了一种重组载体的应用。

第一方面，本发明提供了一种重组载体，包含如SEQ ID NO：1所示的基因，所述重组载体为重组pPICZaA质粒，所述基因插入所述pPICZaA质粒的多克隆位点。

本发明采用的pPICZaA质粒含有His标签（组氨酸标签）和c-myc标签，能使表达后的蛋白带上这两种标签，His标签有利于表达后融合蛋白的分离纯化，c-myc标签有利于融合蛋白在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。

优选地，如第一方面所述的基因插入pPICZaA质粒的Xho I和Xba I位点。

第二方面，本发明提供了一种重组菌，包含如第一方面所述的重组载体，所述重组菌为重组毕赤酵母GS115菌株。

本发明提供的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列包括Kex2蛋白酶酶切位点的编码序列和CTLA4胞外区的编码序列（Gene Bank克隆号：NM-005214.3）。

Kex2蛋白酶位于酵母细胞膜中，是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点Lys-Arg，通过对酶切位点之前的信号肽的切割而得到天然N端的CTLA4蛋白（由于本发明提供的Kex2酶切位点的上游是质粒的Xho Ⅰ位点，下游紧邻CTLA4蛋白胞外区序列，因此，切割后能得到天然的N端CTLA4蛋白胞外区；该天然N端是指在CTLA4蛋白胞外区的N端不含有其它任何多余系列）。

本发明提供的如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在酵母中表达后，能得到含有Kex2蛋白酶酶切位点的CTLA4胞外区融合蛋白，该Kex2蛋白酶酶切位点经酵母细胞膜的Kex2蛋白酶切割，促使CTLA4胞外区融合蛋白分泌到胞外。

第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）、设计CTLA4基因胞外区片段的上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

（2）、提供或制备CTLA4基因模板，并以步骤（1）所得上游引物和下游引物为PCR引物，扩增CTLA4基因胞外区片段；

（3）、取pPICZaA质粒，将步骤（2）扩增得到的CTLA4基因胞外区片段和所述pPICZaA质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组载体。

优选地，所述步骤（2）中，所述CTLA4基因模板为含有CTLA4基因的重组载体pGEM-T-CTLA4。