[发明专利]一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种重组表达甘露聚糖酶的工程菌株及其应用。

背景技术

甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。它不仅能够降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有所提高。

甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其它植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量分别为22.7％、11.9％、19.6％和33.7％。

我国猪、鸡的主要日粮是玉米-豆粕型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％。单胃动物对豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有的22.7％的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖，降低消化道内容物粘度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。因此，目前对甘露聚糖酶的研究是热点内容。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘露聚糖酶的重组表达菌株，本发明通过将来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的甘露聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到了高效重组表达甘露聚糖酶的工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌，其携带有能表达甘露聚糖酶的重组质粒。

所述重组质粒含有枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因。

所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

本发明的另一方面涉及上述甘露聚糖酶在饲料中的应用。

本发明通过将枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶基因导入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达甘露聚糖酶，摇瓶发酵酶活达912U/mL。重组甘露聚糖酶的最适作用pH为4，最适作用温度为58℃。通过在日粮中添加本发明的甘露聚糖酶，实验组肉鸡日增重、育肥指数比正对照组分别高2%、2.6%，料肉比比正对照组降低了5.6%，说明本发明的甘露聚糖酶能显著提高饲料的利用率，提高肉鸡的日增重和育肥指数，降低料重比，从而可以减少畜禽养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1  甘露聚糖酶基因的克隆

挑取新鲜的枯草芽孢杆菌CGMCC1.897（购自中国普通微生物菌种保藏管理中心）单菌落于5mL LB液体培养基中，37℃摇床200rpm振荡培养过夜，按照Tiangen 细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）的说明提取染色体。

根据NCBI上甘露聚糖酶同源序列设计引物，以枯草芽孢杆菌CGMCC1.897染色体为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为： 94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环后，72℃延伸10min。凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将该产物命名为Man-1。

将Man-1克隆至pMD18-T载体，构建得到质粒pT-Man-1，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得Man-1基因序列为SEQ ID NO:1，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:2。将该序列进行NCBI同源序列比对，确定Man-1基因为一新的甘露聚糖酶基因，与现有公开序列相似性最高为88%。

实施例2  表达载体的构建