[发明专利]一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种农杆菌介导的真菌遗传转化方法，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导遗传转化稻曲菌的改良方法。

（二）背景技术

稻曲菌(Ustilaginoidea virens(Cooke)Tak)属子囊目、麦角科、拟黑粉属。水稻稻曲病是由稻曲菌引起的水稻真菌病害。稻曲病在历史上对水稻的危害损失并不严重，但是随着全球气候变化和我国高产优质杂交稻大面积推广以及水稻水肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重。稻曲病菌不但侵染水稻，还可以侵染玉米和田间一些杂草如马唐属和水社黍以及野生稻。水稻发生稻曲病后，不仅降低稻谷产量及质量，而且病粒含有毒素，这种毒素能引起人畜慢性中毒，极大的影响了我国粮食高产稳产和粮食食品安全。对稻曲菌的研究也逐渐引起世界各国的重视。

近年来，随着分子生物学向真菌学的渗透和发展，真菌的遗传转化也越来越受到重视。真菌基因工程是进行真菌遗传研究的重要途径。真菌有坚韧的细胞壁结构，迄今所建立的真菌遗传转化技术均有利弊。例如电转化虽然实验过程简单，但需要昂贵的仪器设备，而PEG介导的原生质转化法虽然不需要仪器，但是需要制备原生质体，制备过程大多程序繁多，最终因原生质的破裂而转化率极低。目前，农杆菌介导转化技术在植物上应用较为广泛，但在真菌中的应用还不是很多，根癌农杆菌介导的转化法近几年在一些真菌中出现有报道，例如利用根癌农杆菌转化了黑曲霉(Aspergillus niger)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、链孢霉(Neurospora crassa)、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、稻瘟菌（Magnaporthe grisea）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、红曲霉(Monascus purpureus Went)等多种真菌。根癌农杆菌介导的转化法因而成为真菌遗传转化和基因克隆的强有力工具。但是不同的真菌物种有不同的生理特性，目前真菌利用农杆菌介导的方法转化率有待提高，转化子的稳定性也需要提高。稻曲病是水稻上的重要病害之一，农杆菌介导稻曲菌转化的相关研究国内外还很少见报导，2006年张震进行了根癌农杆菌介导遗传转化稻曲病菌的初步研究（中国水稻科学,2006,20(4):440-442），但是转化率偏低，而且无法确定转化子的稳定性和拷贝数。因此，有必要建立一套农杆菌介导的高转化率的稻曲菌的遗传转化技术，为稻曲病菌的致病机制研究、致病相关基因克隆以及为寻求控制该病害的有效途径奠定基础。本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种根癌农杆菌介导的稻曲菌高效转基因方法，以弥补现行真菌转基因技术转化率普遍偏低、外源基因不稳定的缺陷。

本发明涉及的一种农杆菌介导的稻曲菌遗传转化方法，该方法适用于稻曲菌的各种产孢的菌种类型。通过这种方法，可以成功实现在短时间内稻曲菌的遗传转化。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种农杆菌介导遗传转化稻曲菌的高效方法，使得在短期内可以获得大量的转化子，可以成功实现在短时间内稻曲真菌的遗传转化，为稻曲菌的致病机制研究建立良好的技术平台。

本发明采用的技术方案是：