[发明专利]一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，属于生物制品技术领域。

背景技术

圆环病毒病感染是近年来发现的一种比较难控制的传染病。该疾病主要侵害哺乳仔猪和育肥猪，及怀孕母猪。其特征性临床症状为患猪体质不良，皮肤苍白。引起的疫病包括猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，增生性坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等。同时PCV-2感染产生的免疫抑制极易引发其它病原混合感染或继发感染。2006、2007年，猪圆环病毒在中国猪“无名高热症”发生中起着重要的诱因作用。目前，圆环病毒病在我国已普遍发生，表现为流行范围广、阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点，给我国养猪业造成严重的经济损失。由于本病的危害日益严重，已引起人们的密切关注，养猪行业人士更将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。疫苗免疫是预防该病发生的最有效方法之一。

使用生物反应器大规模培养细胞，获得高病毒含量抗原，是当前生物制品生产和疫苗行业发展的主流模式和必然趋势。使用生物反应器比传统的转瓶培养工艺具有不可比拟的优势，比如：利于对污染和内毒素的控制，大幅度提高细胞密度和毒液抗原含量，抗原批间次差异小，培养基血清含量低，疫苗质量均一，疫苗注射反应小、免疫抗体水平高、整齐、免疫持续期长，减少对厂房面积的需求，减少对人力的依赖，可以实现远程监视与控制等常规细胞培养所不具备的多种技术优势。

目前，国内常规生产猪圆环病毒2型（PCV2）工艺主要是转瓶生产培养，产出的PCV2的病毒滴度均在10^5.0左右，利用生物反应器及片状载体生产工艺，可提高PCV2病毒产量和滴度，可以产出滴度高达10^6.5TCID₅₀/ml以上的病毒液，病毒产量是传统转瓶工艺的100倍左右。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种应用生物反应器及片状载体扩增猪圆环病毒2型的方法，本发明逾越了转瓶生产工艺存在的多种技术瓶颈，提供了一种利用片状载体悬浮培养PK15细胞，获得高效、可持续性、大规模生产高滴度圆环病毒2型（PCV2）病毒液的工艺。

一种应用生物反应器及片状载体大规模扩增猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：

1）使用转瓶培养制备密度为2～3×10⁵个/mL的PK-15细胞液；

2）于生物反应器内接种所述细胞液，加入片状微载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，进行细胞悬浮培养，其中：每接种1L的所述细胞液，加入所述片状微载体250g，然后补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4～5L；

3）接种细胞24小时后进行灌注培养，设定搅拌转速为85～100转/分，溶氧为40～50%，pH为7～7.2，温度为36.8～37.3℃；

4）所述PK-15细胞悬浮培养至72小时接入猪圆环病毒2型（PCV2），病毒接种量为生物反应器培养基8%（V/V），并同时加入终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，所述生物反应器参数设置为90～100转/分，溶氧为50～55%，pH为7.2～7.4，温度为36.4～36.8℃；

5）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种24小时后至240小时采用灌注工艺培养，使用体积百分比为1%的牛血清培养基进行灌注，生物反应器参数与步骤4）相同，其中：所述步骤2）中每接种1L的所述细胞液，此步骤中灌注量为平均每天15L；

6）所述猪圆环病毒2型（PCV2）病毒接种后240～360小时停止培养，将灌注培养工艺收集的病毒液与生物反应器内的病毒液混合，反复冻融两次，冻融过程中不断摇晃，即得猪圆环病毒2型（PCV2）病毒液。

以5L工作体积为例，本发明一个PK-15细胞悬浮培养猪圆环病毒2型（PCV2）周期为13天，共收获病毒液量约150L左右。

其中，所述生物反应器可选用美国NBS公司生产的7.5L生物反应器，所述片状载体可选用美国NBS的Fibra-Cel Disks。

优选的，所述的步骤3）中培养条件为：搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.2，温度为37℃。

优选的，所述的步骤4）中的培养条件为：搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.4，温度为36.5℃。

优选的，所述的步骤5）中的培养基中牛血清的质量百分含量为1%。