[发明专利]长效重组绒促性素及其应用

权利要求书

1.重组HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含HCGβ亚基、HCGα亚基、肽接头和人IgGFc变体。 

2.根据权利要求1所述的重组HCG-Fc融合蛋白，其中所述的HCGβ亚基的氨基酸序列是去除了常规HCGβ亚基中的1-18位氨基酸残基之后的HCGβSEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；其中所述的HCGα亚基的氨基酸残基序列是去除了常规HCGα亚基中的1-24位氨基酸残基之后的HCGαSEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；其中所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于HCGα亚基和人IgG Fc变体之间，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸，优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 

3.根据权利要求1的重组HCG-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG Fc变体选自下组： 

(i)含有Pro331Ser突变的人IgG2绞链区、CH2和CH3区域； 

(ii)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； 

(iii)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域。 

4.根据权利要求1所述的重组HCG-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2、4和6所示。 

5.编码根据权利要求1的重组HCG-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQ ID NO：1、3和5所示。 

6.一种权利要求1的重组HCG-Fc融合蛋白的制备方法，其步骤包括： 

1)构建编码重组HCG-Fc融合蛋白的基因表达载体： 

采用人工合成方法获得编码HCG-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有HCG-Fc融合蛋白基因的表达质粒； 

2)重组HCG-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达： 

将含有HCG-Fc融合蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达HCG-Fc融合蛋白的细胞株； 

3)高密度细胞培养重组HCG-Fc融合蛋白： 

将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×10⁷个／mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加； 

4)重组HCG-Fc融合蛋白的纯化制备： 

a)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲 和ProteinA柱层析； 

b)疏水层析柱纯化：经疏水层析纯化进一步去除上述Protein A纯化后目标蛋白中的杂质； 

所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4Fast Flow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。 

7.根据权利要求6所述的重组HCG-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤1)中所述的基因表达载体为pCDNA3、pCMV／ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT或pCMV-DHFR，优选，pCDNA3；其中步骤2)中所述的细胞转染方法包括电穿孔转染方法、磷酸钙转染、脂质体转染和原生质融合，优选，电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO，HEK293、BHK、NS0和Sp2／0细胞，优选，CHO细胞，更优选，DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。 

8.根据权利要求6所述的重组HCG-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤3)中还包括在培养基中加入添加剂，优选，在基础培养基加入100μM Cu²⁺，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。