[发明专利]长效重组人绒促性素融合蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药领域。更具体地，本发明涉及长效重组人绒促性素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，生物利用度显著增加，大大减少用药次数和剂量，降低副作用。

背景技术

人绒促性素(Human chorionic gonadotrophin，简称HCG)是人类生殖领域常用的药物主要成分，广泛应用于妇产科和不孕症治疗，主要用途包括诱发排卵，促进精子发育，治疗功能性子宫出血和习惯性流产，防治早产，缓解生产疼痛等。目前我国市场上的HCG主要为孕妇尿液中提取的产品，存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等缺陷，欧美等发达国家普遍不接受尿源产品上市和销售。

相比而言，重组HCG是通过基因工程和哺乳动物细胞培养生产的产品，其在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有尿源HCG产品无法比拟的优点。HCG是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为50KD。另外，HCG是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证HCG的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cell，简称CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

虽然目前已有利用CHO细胞生产的重组药物HCG上市，但仍然存在如下问题：首先，其半衰期较短，临床上为了达到有效的治疗效果，需要频繁给药，给患者带来极大痛苦。例如，当用于促排卵时，患者须每日肌肉注射1-2次HCG，通常需要连续注射5天。这种治疗方案常伴有不良的副作用，包括对神经、内分泌和免疫系统的刺激和毒副作用，并导致常见的并发症如卵巢过度刺激综合征，表现为卵巢增大、全身毛细血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重组HCG表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。另外，HCG是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证HCG的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。针对现有重组HCG及同类产品的缺陷，本发明利用现代分子生物学技术、细胞生产和蛋白纯化工艺开发新型的重组HCG产品，以延长半衰期、提高生物利用度和提高重组HCG蛋白表达水平，从而减少给药次数和剂量，降低副作用。

发明内容

本发明旨在提供一种重组人绒促性素融合蛋白(Human chorionic gonadotrophin-Fc fusion protein，简称HCG-Fc)及其制备方法及应用，以解决现有技术中重组HCG表达量低、纯化难、体内半衰期短的问题。

本发明的一个目的是提供重组HCG-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含HCGβ亚基、HCGα亚基、肽接头(Linker，简称L)和人IgG Fc变体(vIgG2Fc、vIgG4Fc和vIgG1Fc)，如SEQ ID NO：2、4和6所示(HCGβ-HCGα-vIgG2Fc、HCGβ-HCGα-vIgG4Fc、HCGβ-HCGα-vIgG1Fc氨基酸序列)，优选的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(HCGβ-HCGα-vIgG2Fc)，上述融合蛋白统称为HCG-Fc。

所述的HCGβ亚基的氨基酸序列去除了完整HCGβ亚基中的1-20位氨基酸残基，即成熟HCGβ亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

所述的HCGα亚基的氨基酸残基序列去除了完整HCGα亚基中的1-24位氨基酸残基，即成熟HCGα亚基的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示。

所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。