[发明专利]猪带绦虫TSO45W-4B基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪带绦虫TSO45W-4B基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法。

背景技术

猪囊尾蚴病（Cysticercosis cellulosae）又称囊虫病（Cysticercosis），是由猪带绦虫（Taenia solium）的中绦期幼虫寄生在人体皮下、肌肉、脑、眼等脏器引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病，已成为全球性的公共卫生问题，我国也是猪囊尾蚴病高发国家之一，以东北、华北、西北、西南地区发病率较高，全国约有200万～300万囊虫病患者，感染率为0.14%～3.20%。药物及手术治疗都有其局限性，研制疫苗防治该病已成为当前研究热点。

TSO45W-4B基因是猪带绦虫六钩蚴阶段重要的免疫原基因，被认为是最具前景的疫苗候选基因。双歧杆菌(Bifidobacteria,Bb)是人和哺乳动物肠道内重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫调节和营养等多种生理作用。近年来，随着基因工程技术的发展，以Bb为载体传递系统，已在细菌、病毒、肿瘤等领域构建了一系列重组双歧杆菌。而在寄生虫领域方面，尚未见猪带绦虫重组Bb的报道，因此，本研究拟通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B，电穿孔转化长双歧杆菌(B.longum)，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B)疫苗，为猪囊尾蚴病的防治提供一种有价值的新型疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B，电穿孔转化长双歧杆菌(B.longum)，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B)疫苗，为猪囊尾蚴病的防治提供一种有价值的新型疫苗。

本发明的技术方案是：一种猪带绦虫TSO45W-4B基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，包括以下步骤：

（1）TSO45W-4B基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSO45W-4B基因序列，通过全基因合成的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和保护性碱基，合成长度为351bp的TSO45W-4B基因； 

（2）重组质粒pGEX-TSO45W-4B的构建及鉴定：合成基因的PCR产物与克隆载体pMD18-T在T4DNA连接酶作用下，连接，连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴冷却后加入LB培养液，振摇，离心，弃上清，剩余200μl混匀涂于含Amp的LB琼脂平板上，倒置培养12～16h；挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，振摇培养，提取质粒，进行PCR鉴定；然后将重组质粒pMD18-T-TSO45W-4B与表达载体pGEX-1λT分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，胶回收相应片段后用T4DNA连接酶连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定；

（3）猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B)疫苗的构建及鉴定

①B.longum感受态细菌的制备：将B.longum冻干粉用无菌水充分溶解后，涂布于MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h，使其充分活化；挑取活化的单菌落，接种于MRS液体培养中厌氧培养；然后按1:25比例接种于含蔗糖的MRS培养基中，厌氧培养24～72h；冰浴，离心，弃上清，沉淀用预冷的蔗糖清洗，再用蔗糖缓冲液重悬；此细菌可立即用于电转化，或者加入预冷的甘油，-80℃冻存备用；

②重组质粒pGEX-TSO45W-4B电转化B.longum感受态细菌：取备用的重组质粒pGEX-TSO45W-4B与B.longum感受态细菌混匀，冰浴10～15min后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液涂布于含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h； 

③猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B)疫苗的鉴定：挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS培养基的EP管中，厌氧培养24～72h；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴，期间振荡使其充分反应；抽提质粒，进行酶切、PCR和测序鉴定。 

步骤②中所述电击参数设置为：电压1.25KV、场强12.5 KV/cm、电容25μF、电阻200Ω、转化时间5ms。