[发明专利]利用毕赤酵母生产重组几丁质酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种利用毕赤酵母生产重组几丁质酶的方法。

背景技术

几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软件动物的器官（例如乌贼的软骨），以及真菌类的细胞壁等。其蕴藏量在地球上的天然高分子中占第二位，估计每年自然界生物的合成量可达1×1011吨，仅次于纤维素。

一般由虾蟹壳提炼的几丁质，约含有15%的胺基（-NH2）与85%的乙醯基（-COCH3）。几丁质不溶于一般的弱无机酸或有机溶剂，且不溶于碱液中，只溶于强无机酸。几丁质具有强吸湿性，保湿效果亦相当好，并且具有吸附重金属离子的功能。

几丁质酶的主要作用包括，防止癌细胞转移、抑制癌症的作用、改善酸性体质效果、除菌作、改善糖尿病、增加肠内有益菌、镇痛止血效果、抑制高血压和强化肝机能等作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用毕赤酵母生产重组几丁质酶的方法，它能快速生产几丁质酶，具有成本低、操作简单的提点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种利用毕赤酵母生产重组几丁质酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）菌种选择；

（2）培养基的制备；

（3）发酵培养；

（4）粗酶液的制备；

（5）几丁质酶活力测定。

进一步的：所述步骤（1）选用的菌种为P.pastoris GS115菌株，遗传表型Mut⁺，醇氧化酶启动子为AOxl,构建载体。

进一步的：所述步骤（2）中的培养基包括YPD、BMGY、BMMY和斜面培养基

其中,YPD含有1.0％酵母抽提物+2.0％蛋白胨+1.0％葡萄糖，斜面培养基1.0％酵母抽提物+2.0％蛋白胨+1.0％葡萄糖+1．5％琼脂，BMGY含有1．O％酵母抽提物+1.0％甘油+2.0％蛋白胨+0.1mo1／L磷酸缓冲液+1.34％YNB+(4×10^-5)％生物素。BMMY含有1.0％酵母抽提物+0.5％甲醇+2．0％蛋白胨+0.1ml／L磷酸缓冲液+1.34％YNB+(4×10^-5)％生物素，上述浓度均为培养基终浓度。

进一步的：所述步骤（3）发酵培养步骤为：于30℃生长2d的新鲜平板上取两环单菌落接到种子培养基中摇瓶培养约18h，再以10％的接种量转接到BMGY中培养24h，离心弃上清液，菌体转接到BMMY开始诱导，每隔12h补加甲醇至预设浓度，摇床温度为30℃，转速200r/min，装液量为30mL/150mL。

进一步的：所述步骤（4）粗酶的制备是将发酵液在4℃条件下15000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

本发明的有益技术效果是：本发明技术方法能够快速制备几丁质酶，具有操作简便，生产成本小的特点。 

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施实例一

（1）选用的菌种为P.pastoris GS115菌株，遗传表型Mut⁺，醇氧化酶启动子为AOxl；

其中，本发明所用P.pastoris GS115菌株购自invitrogen公司。

（2）培养基的制备：培养基包括YPD、BMGY、BMMY和斜面培养基，其中,YPD含有1.0％酵母抽提物+2.0％蛋白胨+1.0％葡萄糖，斜面培养基1.0％酵母抽提物+2.0％蛋白胨+1.0％葡萄糖+1．5％琼脂，BMGY含有1．O％酵母抽提物+1.0％甘油+2.0％蛋白胨+0.1mo1／L磷酸缓冲液+1.34％YNB+(4×10^-5)％生物素。BMMY含有1.0％酵母抽提物+0.5％甲醇+2．0％蛋白胨+0.1ml／L磷酸缓冲液+1.34％YNB+(4×10^-5)％生物素，上述浓度均为培养基终浓度；

（3）发酵培养：于30℃生长2d的新鲜平板上取两环单菌落接到种子培养基中摇瓶培养约18h，再以10％的接种量转接到BMGY中培养24h，离心弃上清液，菌体转接到BMMY开始诱导，每隔12h补加甲醇至预设浓度，摇床温度为30℃，转速200r/min，装液量为30mL/150mL；