[发明专利]缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用

说明书

技术领域

本发明属于多肽基因工程综合技术；更具体地，本发明涉及缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用。

背景技术

中国是世界上糖尿病大国之一，2012年糖尿病患者9000万，其中90%为2型糖尿病，迫切需要高效、廉价的抗糖尿病药物的治疗。

英国的UKPDS对现有的6种抗糖尿病药物评价如下：没有一个能阻止胰脏β-细胞，不断进行性地凋亡，不能恢复β-细胞的功能，不能阻止糖尿病综合征的发生，心脏病，肾衰竭(Diabetes，1995，44，1249)。美国NIH的报告指出，尽管严格控制血糖，糖尿病患者心脏病死亡率仍高于非糖尿病患者2-4倍。这些结果说明，需要能阻止β细胞凋亡，增加β-细胞总量的治疗药物。

目前，一些新一代的抗糖尿病多肽已经进入中国，包括Eli-Lilly的Extendin4(39aa)，丹麦Novo Nordisk的liraglutid(31aa-C16脂肪酸衍生物)，法国Sanofi的GLP lyxumia(44aa)。这些药物代谢产物为氨基酸，随着血糖的降低至正常，停止作用，不产生低血糖休克，较为安全，减少跟踪进行血糖测定的麻烦。还能增加β-细胞总量，增加胰岛素分泌和敏感性等。但是，这些多肽药物都是化学合成品，合成过程需要经过30-44步完成，价格十分昂贵，每人每年约需花费2万元医药费。

Exendin4是一条长度为39aa的多肽。尽管Exendin4已经被研究多年，然而美国FDA在2005才正式批准其作为临床药物。从临床数据看，Exendin4比glargin，liraglutid，lyxumia，GLP-1临床效果好，Exendin4维持降血糖时间相对比GLP-1长，用药剂量比GLP-1低，注射次数比GLP-1少。

但是，Exendin4肽链比较长，具有免疫原性，终身用药对于健康极其不利。并且，Exendin4的基因工程难度比较大，基因工程量产困难。为了除去免疫原性，需要缩短肽链长度，但NIH的报告指出；Exendin4C-端9个氨基酸残基一个也不能少，都是必需的(Regulatory Peptides2003，vol.114，153-158)。上述问题给Exendin4的临床应用带来极大阻碍。

因此，本领域非常有必要进行进一步的抗糖药物的研究和改良，研发出副作用更低且更为廉价的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供缩短肽链的Exendin4及其基因工程应用。

在本发明的第一方面，提供一种缩短肽链的Exendin4变体，该Exendin4变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种编码所述的缩短肽链的Exendin4变体的多核苷酸，该多核苷酸的SEQ ID NO:2中第16-117位所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体包含所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的重组表达载体中包括12拷贝的所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组宿主细胞，所述的宿主细胞中包含有所述的重组表达载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸；较佳地，整合12拷贝的所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的重组宿主细胞是大肠杆菌细胞；优选地是JM103或JM109。

在本发明的另一方面，提供一种重组表达所述的缩短肽链的Exendin4变体的方法，所述的方法包括：培养所述的重组宿主细胞，从而表达所述的缩短肽链的Exendin4变体。

在一个优选例中，所述表达方法中，培养基含：蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，K₂HPO₄·3H₂O12g/L，NaH₂PO₄·3H₂O2g/L，50%甘油7ml/L；

培养条件：37℃，搅拌速度500rpm，PH6.5～7.5，通气量30L/min。发酵过程中不断取液，离心后称重，在Log phase中期加入IPTG，终浓度0.3mM，继续发酵4小时后停止发酵；4000rpm离心收集菌体；

收集的菌体在冷却条件下，利用超声波破碎菌体。离心分离包涵体，再经2M尿素洗涤一次；