[发明专利]手足口病病毒等温扩增检测试剂盒

权利要求书

1.一种手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，包括：1）等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；其特征在于，所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；

其中：

所述的正向引物的碱基序列为SEQ ID No.1：

ACACAGGTGAGCAGTCATCG；

所述的反向引物的碱基序列为SEQ ID No.2：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；

所述的分子信标的碱基序列为SEQ ID No.3：

CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG。

2.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的等温扩增缓冲液包括Tris HCl40mM、KCl70mM，MgCl₂12mM，DTT10mM，dNTP1mM，rNTP2mM，山梨糖醇375mM。

3.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的反应酶由T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H组成。

4.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品为重组质粒pET-32a。

5.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品的浓度为10⁵copies/反应～10²copies/反应。

6.根据权利要求3所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。

7.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的分子信标荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

8.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的分子信标使用浓度为100nM。

9.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的等温扩增反应的条件为：65℃5min、42℃5min预处理，加入酶液42℃反应90分钟。

10.根据权利要求1所述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性质控标准品的构建方法是采用PCR方法对EV71cDNA模板进行扩增，得到所需的EV71VP1基因序列，序列片段经双酶切后与相应双酶切pET-32a质粒载体进行连接，用氯化钙法转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，并进行双酶切验证以获得所需的阳性质控样品。