[发明专利]犬细小病毒单域抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于临床兽医及抗体工程技术领域，涉及到一种病毒抗体，特别是涉及一种主要依托羊驼的重链抗体来实现其生物表达的犬细小病毒单域抗体，以及该抗体的制备方法和应用。

背景技术

犬细小病毒病由犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起，以发病率高、死亡率高、传染性强为特点，一年四季皆可发生，出血性肠炎型和心肌炎型犬细小病毒病的死亡率分别为10%～50%、60%～100%，可造成严重经济损失。预防犬细小病毒病的疫苗主要有：灭活苗、弱毒苗和多联苗，优化的免疫程序可取得较好的免疫效果。但是对市场上疫苗的免疫效果进行检测调查研究发现，仅20%的疫苗能产生100%保护力的抗体。资料表明，我国宠物犬数量达1.5亿，随着宠物犬的数量增多，研究犬细小病毒病的诊断和防治具有重要意义。

基于抗原与抗体特异性结合的诊断试剂盒，可检测抗原，也可检测抗体，敏感性高、特异性强、稳定性好、操作简便快速、结果易于分析判定。特异性的抗体对于诊断试剂盒的生产至关重要，目前常用抗体有单克隆抗体、多克隆抗体。在治疗方面，早期应用犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等进行特异性治疗，可以取得较好的效果。但单克隆抗体规模化生产耗时长，抗血清规模化生产不能保证市场需求而且质量不稳定，而且单克隆抗体和抗血清的免疫原性强，在治疗过程中都存在副作用。因此，研究相关特异性强、亲和力高、免疫原性低、可规模化生产的抗体具有重要意义。

普通抗体IgG(免疫球蛋白G)是血清中最重要的抗体，约占血清中免疫球蛋白总量的75%～80%，在体液免疫中起着“主力免疫”作用。IgG具有2条重链(H链)和2条轻链(L链)，整个抗体分子分为恒定区(C区)和可变区(V区)，分子量为150～160kDa。研究表明，羊驼血清中除了普通抗体IgG，有近一半的IgG为重链抗体，只具有重链可变区(VH)、一个铰链区和两个恒定区(CH2和CH3)，而对重链抗体的可变区克隆构建只有一个重链可变区的抗体称为单域抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，分子量仅为15kD，具有分子量小、结构单一、穿透性好、特异性强、亲和力高以及可溶性高、稳定性强、易克隆、高表达、易纯化等特点。因此，VHH可减少治疗过程中的副作用，可作为生物传感器诊断用靶标试剂，可用于构建免疫融合物、进行靶向治疗，可用于商品化大规模生产。目前，抗体在疾病的治疗方面仅限于细胞表面靶标，全抗体由于分子结构复杂，在细胞内表达困难，限制了其在细胞内的应用，VHH免疫原性低，很难激发T细胞的免疫反应，可以作为治疗性抗体而长期用药。总之，VHH作为一种小型化的基因工程抗体，独特的理化和生物学特性使其在基础研究、药物开发和疾病诊断治疗等领域具有广阔的应用前景。

随着对基因表达的深入研究，抗体库的出现为抗体制备提供了一种新的手段，利用抗体库技术能够实现抗体的规模化制备，相关的噬菌体展示技术也是近年来建立和发展的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术，其基本原理是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白的基因相连，插入到噬菌体的表达载体上，从而使多肽或蛋白质与外壳蛋白融合表达并展示在噬菌体的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性；利用噬菌体在大肠杆菌系统易于分离扩增，可以通过与配体的结合选择出表达相应受体的噬菌体颗粒，通过“吸附-洗脱-扩增”的富集过程，可从中筛选出特异性抗体基因，并可直接测定所展示的多肽或蛋白质的某些生物学活性。这些技术在抗体工程中已有应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有犬细小病毒单克隆抗体及犬细小病毒抗血清等特异性治疗制剂的缺陷，提供一种分子量小、免疫原性低、特异性强、稳定性强、易克隆表达的犬细小病毒单域抗体，以及该犬细小病毒单域抗体的制备方法和应用。

为达到上述发明目的，本发明利用噬菌体展示技术，从犬细小病毒灭活疫苗免疫羊驼的外周血中提取RNA，构建CPV-VHH犬细小病毒单域抗体库，并从抗体库中筛选获得具有生物活性的单域抗体。

本发明的犬细小病毒单域抗体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明上述犬细小病毒单域抗体采用以下步骤进行制备：

1)、提取经犬细小病毒免疫后羊驼外周血中的RNA，反转录生成cDNA；特异引物扩增纯化犬细小病毒单域抗体VHH片段；