[发明专利]枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及芽孢杆菌，尤其是涉及一种枯草芽孢杆菌Pc3及其在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。

背景技术

随着植物病虫害对已有农药的耐药性及新病害的出现，要求不断开发新的农药。微生物资源一直是农业工作者研究的重点资源，寻找新的微生物源先导化合物或活性产物是农药创制的主要手段之一。但是由于研究开发时间长，对筛选技术要求较高，筛选得到新型农用活性物质越来越困难。从新药研发的进程来看，绝大部分还是来自于自然资源(Bevan et al.1995)，其中包括微生物和植物提取物的活性筛选(Shadomy.1987)。

随着陆地微生物资源的日渐枯竭，从陆源微生物中发现新结构活性物质的几率越来越小。新的微生物类群在微生物代谢产物研究领域越来越受到人们的重视，而且也是筛选新的微生物代谢产物的一条重要途径。近年对海洋和极地微生物资源的研究结果充分证明，利用海洋和极地微生物资源研制开发新型药物具有着巨大的潜力和诱人的前景(Zhang et al.2005)。

南极由于其独有的地理及气候特征，是一个潜在的、有待开发的微生物资源库。它不仅是独特生态系统微生物的生存繁衍地，而且是新型生物活性物质（如酶、多糖及脂类等)和先导化合物合成菌株的潜在种源地。在这种特殊的生态多样性环境中生存的微生物，可能具有不同于陆生微生物的独特的遗传和代谢多样性。因此，南极微生物资源可能是新型化合物或新型活性代谢产物的潜在来源。

芽孢杆菌是一类好氧、能产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌。这类菌能产生脂肽抗生素、细胞壁降解酶类、细菌素、抗菌蛋白及挥发性抗菌物质，对某些植物病原真菌或细菌、甚至某些动物病原菌、病毒等表现出一定的抑制作用（(Stein2005）。同时，这类细菌可以通过发酵大规模获得，且产生的芽孢对高温、强酸、紫外线具有很强的耐受力。因此，有关芽孢杆菌的研究已成为近几年国内外的研究热点之一。已报道的能抑制真菌生长的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuriniensis)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloloquefaci)等。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3。

本发明的目的之二在于提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3在制备防治植物致病真菌发酵上清液中的应用。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3分离自中国第28次南极科学考查所采集的海水样品（D3-3站点；W50.76°，N61.16°）；该菌已于2013年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学，邮编为430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2013470。

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pc3分离自中国第28次南极科学考查所采集的海水样品，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其16S rDNA序列，与美国国家生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属(Bacillus sp.)具有99%的序列相似性；16S rDNA序列的GenBank登录号为KF751703。

为实现植物致病真菌防治的目的，首先将该菌在含有5ml LB培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到1L发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到发酵上清液，该发酵上清液直接喷洒植物用于致病真菌的防治。

所述LB培养基的组成如下（g/L）：葡萄糖20，KH₂PO₄6，K₂HPO₄14，MgSO₄0.2，(NH4)₂SO₄4，2ml微量元素（FeSO₄·4H₂O，CaCl₂·2H₂O，MnSO₄·4H₂O，ZnCl₂各1mM，过滤除菌后放入无菌试剂瓶中备用），0.1MPa灭菌30min。

所述离心除去菌体是指在6000～8000g下离心10min。