[发明专利]甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物、探针及试剂盒。

背景技术

流感病毒属正粘病毒科，系RNA病毒。根据病毒膜蛋白和核蛋白的差异，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现先后顺序，也反映了对人类、动物的危害程度的大小。流感病毒特点是容易发生变异，其中甲型流感病毒最容易发生变异，可感染人和多种动物，为人类流感的主要病原，常引起大流行和中小流行。乙型流感病毒变异较少，能否感染人以外的其他动物至今不肯定，引起爆发或小流行。丙型较稳定，可感染人类，多为散发病例，目前已证实猪也可被感染。根据病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的结构及其基因特性的不同，可分为不同亚型。甲型流感病毒可分为15个H亚型和9个N亚型，仅3个H亚型(H1、H2、H3)和2个N亚型（N1、N2）在人间传播。一些低等动物和禽鸟类是自然宿主。乙型流感病毒间同样有变异，但未划分成亚型转变。

流感病毒主要依靠实验室进行确切诊断，传统的诊断方法主要包括血清学检测及病毒的分离和鉴定两个方面。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，分子生物学技术也已广泛应用于流感病毒的检测，其中又以实时荧光PCR技术在流感病毒分子诊断领域发展最快。荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。但是由于流感型别较多，检测一份标本需要同时做多种型别流感的检测，既麻烦又浪费成本，加上单一型别的检测方法不能满足所有流感病毒检测的要求，因此建立单管多重荧光PCR同时检测甲、乙、丙型流感病毒的方法具有非常重要的意义

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用多重荧光PCR法对甲型和乙型流感病毒在单管联合检测的引物、探针、试剂盒及检测方法等，可用于临床可疑感染患者的病原学鉴别诊断。

本发明首先公开了一种针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针，所述引物和探针的组成如下：

甲型流感病毒：

IFVA上游引物:5’-GCTCTCATGGAGTGGMTA-3’               （SEQ ID NO：1）

IFVA下游引物:5’-CGTGAACACAAAYCCYAA-3’               （SEQ ID NO：2）

IFVA探针：5’-荧光报告基团-ACAAGACCAATCCTGTCACCTCTG-荧光淬灭基团-3’                                                             （SEQ ID NO：3）

乙型流感病毒

IFVB上游引物:5’-GTTGGTTTGGTGGGAAAG-3’        （SEQ ID NO：4）

IFVB下游引物:5’-GATAAGGGYTCTGTGATGAA-3’      （SEQ ID NO：5）

IFVB探针：5’-荧光报告基团-TGACCTAGACTCTGCCTTGGAATG-荧光淬灭基团-3’                                                      （SEQ ID NO：6）；

其中，M=A/C，Y=T/C。

针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物具体包括两对引物及其各自对应的探针，分别扩增甲型流感病毒和乙型流感病毒。

本发明探针的设计为现有技术，探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。优选的，所述IFVA探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，IFVB探针标记的荧光报告基团为VIC荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

本发明第二方面公开了一种甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，包括甲乙型流感病毒检测混合液，所述甲乙型流感病毒检测混合液中含有前述的引物和探针。

较优的，所述甲乙型流感病毒检测混合液中还含有RT-PCR MIX和H₂O。