[发明专利]人树突状细胞疫苗的制备方法

权利要求书

1.人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤： 

1)从分离的外周血单核细胞中进一步分离并获取单核细胞； 

2)诱导单核细胞向DC分化； 

3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟的DC；在步骤3)诱导已分化为未成熟DC的单核细胞成为成熟DC的培养过程中，加入IL-1β、IL-6、TNF-α，或者IL-1β、IL-6、TNF-α与Mtb-HAg及IFN-γ中的一种或者两种的组合； 

4)继续培养1-2天，进行DC成熟度和IL-12含量检测。 

2.如权利要求1所述的人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，加入的IL-1β终浓度为8-15ng/mL，IL-6终浓度为50-150ng/mL，TNF-α终浓度为8-15ng/mL，Mtb-Hag终浓度为5～10μg/ml，IFN-γ终浓度为100～1000IU/ml。 

3.如权利要求1或2所述的人树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，加入的IL-1β终浓度为10ng/mL，IL-6终浓度为100ng/mL，TNF-α终浓度为10ng/mL，Mtb-Hag终浓度为8μg/ml，IFN-γ终浓度为1000IU/ml。 

4.根据权利要求1或2所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体为采用聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度离心法获得外周血单个核细胞，然后将外周血单个核细胞重悬于PAA^TM培养基、GT-T551^TM培养基、Opti-MEM^TM培养基的任意一种培养基中，调整细胞密度为(5～10)×10⁶/ml，进行贴壁培养1-2h，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞；补加培养基，轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮，然后吸弃悬浮的未贴壁细胞，重复1～2次；获得贴壁细胞即为单核细胞。 

5.根据权利要求1或2所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)将有8-10％自体血浆、800-1000IU/ml GM-CSF、800-1000IU/ml IL-4的X-VIVO-15^TM培养基或者AIM-V^TM培养基加入步骤1中获得单核细胞培养瓶内，继续培养2-3天；更换新鲜培养基，并在更换的培养基内添加1～20μg/ml的肿瘤抗原。 

6.根据权利要求5所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体为： 

a)：将20ml含有10％自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4的X-VIVO-15^TM培养基或者AIM-V^TM培养基加入步骤1中获得单核细胞的培养瓶内，然后置于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱内培养； 

b)：第三天(72h)，吸弃10ml培养瓶内的培养基，并补加10ml新鲜的含有10％自体血浆、800IU/ml GM-CSF、1000IU/ml IL-4、10μg/ml的肿瘤抗原的X-VIVO-15^TM培养基或者AIM-V^TM培养基。

7.根据权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)DC成熟度的检测方法为流式细胞术，IL-12含量检测方法为ELISA。