[发明专利]抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术及生物医药技术领域，特别涉及一种抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法。

背景技术

Halocidin是一类来源于海鞘（Halocynthia aurantium）的抗菌肽，天然Halocidin含有两个亚单位，18个氨基酸残基的亚单位（Hclocidin 18）和15个氨基酸残基的亚单位（Hclocidin 15）由二硫键结合在一起。Hclocidin18具有良好的抗菌活性，因其对畜禽肠道中许多致病革兰氏阳性菌有很强杀伤作用而备受关注。其抗菌作用与抗生素相当，是最有前景的抗生素替代物质。抗菌肽的生物合成也是目前很多研究人员的热门研究课题。因抗菌肽对细菌的抗菌活性，很难在大肠杆菌表达系统中得到表达。

发明内容

本发明提供一种用于抗菌肽Hclocidin18表达的Hclocidin18基因。

本发明还提供一种抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法，该方法可以使抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中进行高效表达。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种Hclocidin18基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种抗菌肽Hclocidin18在大肠杆菌中的表达方法，其特征在于包括如下步骤：a、质粒构建：采用大肠杆菌进行重组质粒构建，以家蚕质型多角体病毒BmCPV的多角体蛋白作为融合伴侣；b、诱导表达；c、重组质粒编码的融合蛋白的纯化；d、融合蛋白的裂解和抗菌肽Hclocidin18的收集。抗菌肽Hclocidin18的氨基酸序列为WLNALLHHGLNCAKGVLA（SEQ ID No.1）。

作为优选，质粒构建中具体过程如下：

首先，在Hclocidin18基因前加上羟胺裂解位点编码序列，基因片段5’端加入EcoR I，3’端加入Xho I，合成后克隆入pUC18中，构建重组质粒pUC18- Hclocidin18；

其次，以BmCPV基因组为模板，利用PCR扩增得到多角体蛋白基因，采用的上游引物具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，将polh片段克隆入Puc18- Hclocidin18中Hclocidin18基因的前面，得到重组质粒pUC18-polh- Hclocidin18，然后将其中的polh- Hclocidin18融合基因片段克隆入pET30a中，得到的重组质粒命名为pET30a-polh- Hclocidin18。

作为优选，重组质粒pET30a-polh- Hclocidin18编码的融合蛋白在N末端带有His标签，以利于蛋白纯化，其表达在IPTG诱导下完成。

作为优选，步骤d具体如下：将融合蛋白溶液与羟氨裂解反应缓冲液混合，55℃孵育24h， polh- Hclocidin18融合蛋白成功裂解，然后裂解反应样品用20mM pH7.8 PBS透析、离心，获得含有Hclocidin18的上清，保存并冻干后得到Hclocidin18的粗制品。进一步的，羟氨裂解反应缓冲液的组分如下：0.22 M Tris base, 1.7 M hydroxylamine-HCl, 4.5 M gua-nidine-HCl和 1% 1-propanol, pH 9.0；融合蛋白溶液与羟氨裂解反应缓冲液的体积比为1:3。

本发明以家蚕质型多角体病毒（BmCPV）的多角体蛋白作为融合伴侣在大肠杆菌中成功表达了抗菌肽Hclocidin18，同时利用多角体蛋白的碱溶解特性实现了抗菌肽Hclocidin18的高效回收。 

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。本发明中采用的PCR技术为常规技术，本领域技术人员根据本发明的内容结合所掌握的知识可以完成本发明中的相关过程。

实施例：

细菌株系：E. coli DH5α用于重组质粒的构建，E. coli BL21作为表达菌株。金黄色葡萄球菌作为一个典型的格兰氏阳性菌株用于抗菌活性的检测。