[发明专利]肋柱花鉴别的引物及PCR方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及蒙药材及蒙成药鉴定领域，特别涉及一种能够特异鉴定肋柱花的PCR扩增方法及其特异引物。 

背景技术

肋柱花是一种蒙医传统用药，蒙药名哈比日跟一地格达。为龙胆科植物肋柱花(Lomatogonium rotatum(L.)Fries ex Nym.)的干燥全草。用于治疗瘟疫、伤寒、流感、中暑头热等疾病。 

“地格达”来自印度梵语音译，蒙语为苦的意思。作为蒙医常用要药之一，具有清热解毒、凉血消肿、平息“协日”，愈伤之功效。根据文献记载和我们的实际调查研究，内蒙古地区作为“地格达”类蒙药使用的植物多达7科30余种，然而由于内蒙古自治区区域广阔而药用资源物种分布的区域性差异明显，游牧生产过程中徒迁频繁而就地利用药用资源等诸多原因，在蒙药材中，同一品种的名称、基原、临床功效与使用等方面因地、因人而异的现象极为普遍。肋柱花作为“地格达”类药材之一也不例外，同时还调查统计发现含“地格达”类的蒙成药在内蒙古地区使用也较为广泛。由于“地格达”类蒙药基原植物极为复杂，不同科属的植物在不同地区等同入药，致使目前“地格达”类蒙药在不同地区市场流通、医疗部门及制药企业应用十分混乱。这些情况同时也反映出了对蒙成药中使用的“地格达”类生药进行品种鉴定的必要性和迫切性。因此，建立一种用于鉴别肋柱花的方法非常重要。 

之前鉴别肋柱花的方法，如薄层色谱方法等。胡伊力格其等采用薄层色谱的方法通过分析甲醇、乙醚、石油醚部分对肋柱花进行鉴定(胡伊力格其等.四种地格达类蒙药材的鉴别研究，内蒙古民族大学学报，2007，22(3)：328)。本研究组之前使用DNA条形码技术对肋柱花进行分子的鉴别研究，但这种方法比较繁琐，需要测序，不利于推广。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如位点特异性PCR等克服了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点。对 肋柱花及其含有其蒙成药的特异PCR分子鉴别还尚未见报道，本发明通过特异性PCR的方法实现了肋柱花与含肋柱花的蒙成药快速、准确鉴别。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR方法及引物。 

发明内容

本发明的目的是提供一种肋柱花的PCR引物及其鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、样品量少，能快速、准确的将肋柱花从成药中鉴定出来，为肋柱花鉴定提供了一种实用的技术。 

1、一种鉴定肋柱花的特异引物F1、F2，其序列为： 

F1：5’-TTAGTTGTGCCAGAGTTTGC-3’， 

F2：5’-AAGTTCCATCTATAAATGGATAAGA-3’。 

2、一种肋柱花的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： 

a)从所述材料中提取到DNA样品； 

b)用权利要求1所述的引物进行PCR反应，扩增反应体系包括：10×buffer缓冲液2μL，dNTP1.6μL，引物各0.5μL，EX Taq酶0.2μL，DNA0.5μL，灭菌蒸馏水14.7μL。反应条件：解链温度95℃，时间5min，退火温度95℃，时间30s，，54℃，时间30s，复性温度72℃，时间为1min40s，40个循环后72℃延伸，时间为7min； 

c)电泳所述扩增产物，如果存在分子量约为232bp的单一条带，则确定所检材料为肋柱花。 

附图说明

图1：肋柱花及蒙成药PCR鉴别结果 

1.空白对照；2.肋柱花(呼伦贝尔盟)；3.地格达-4汤(阿拉善)；4.地格达-8味散(阿拉善)；5.地格达-4味散(锡林郭勒)；M.DNA分子量标准：从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp 

具体实施方式

1材料 

所用材料如表1所示，包括： 

表1样品来源表 

2鉴别引物设计 

选择通用引物psbA-trnH(trnH：5’-CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC-3’；psbA：5’-GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C-3’)对肋柱花样品进行扩增，搜索Genbank中蒙成药地格达4味汤、地格达4味散、地格达8味散中含有的原料药材的psbA-trnH序列(Genbank登录号见表2)，然后进行同源比对，根据其变异区设计一对特异引物F1、F2，序列为下：