[发明专利]一种菜豆普通花叶病毒的逆转录环介导等温检测方法

权利要求书

1.一组引物，由如下（1）-（4）所示的DNA分子组成：

（1）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

（2）SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（3）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

（4）SEQ ID No.4所示的DNA分子。

2.一种检测菜豆普通花叶病毒的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引物、反转录酶和Bst DNA聚合酶；

所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶。

3.一种检测菜豆普通花叶病毒的方法，该方法是以待测样品的总RNA为模板，以权利要求1所述的引物为引物进行逆转录环介导等温核酸扩增，若得到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选含有菜豆普通花叶病毒，若得不到逆转录环介导等温核酸扩增产物，则所述待测样品中候选不含有菜豆普通花叶病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导等温核酸扩增产物是否得到的判断方法为如下（1）和/或（2）：

（1）将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为含有菜豆普通花叶病毒的样品，不具有弥散状核酸电泳条带的待测样品为不含有菜豆普通花叶病毒的样品；

(2)将逆转录环介导等温核酸扩增反应产物与SYBR Green I反应得反应液，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有菜豆普通花叶病毒的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有菜豆普通花叶病毒的样品。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为外引物，SEQ ID No.3所示的DNA分子和SEQ ID No.4所示的DNA分子为内引物；

所述外引物中SEQ ID No.1所示的DNA分子与SEQ ID No.2所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1；

所述内引物中SEQ ID No.3所示的DNA分子与SEQ ID No.4所示的DNA分子在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比为1:1。

所述外引物与所述内引物在所述逆转录环介导等温核酸扩增中的摩尔浓度比具体为1:5。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导等温核酸扩增中的反应温度为62℃。

7.根据权利要求3-6任一所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导等温核酸扩增中的镁离子浓度为5mM。

8.根据权利要求3-7任一所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导等温核酸扩增的体系如下：

10×Thermopol buffer2.5μL，SEQ ID No.1所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.2所示的DNA分子0.2μM，SEQ ID No.3所示的DNA分子1.0μM，SEQ ID No.4所示的DNA分子1.0μM，dNTPs1.0mM，MgCl25mM，反转录酶200U，Bst DNA聚合酶12U，所述待测样品的总RNA40ng，余量为ddH2O，体系25μL；

所述10×Thermopol buffer购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275；

所述反转录酶为M-MLV反转录酶或AMV反转录酶；

所述Bst DNA聚合酶的商品名称为Bst DNApolymerase，购自纽英伦生物技术(北京)有限公司，产品目录号为M0275；

所述逆转录环介导等温核酸扩增的反应条件为：62℃等温1h；80℃5min。

9.根据权利要求3-8任一所述的方法，其特征在于：所述M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司，产品目录号为2641A；

所述样品具体为待测样品的叶片。

10.权利要求1所述的引物在检测菜豆普通花叶病毒中的应用；

和/或，

权利要求2所述的试剂盒在检测菜豆普通花叶病毒中的应用。