[发明专利]基于长探针同时检测多种微量靶标的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多重性微量检测分析方法，具体涉及一种基于连接酶反应的新型长探针微量核酸电泳检测方法。

背景技术

病原体作为一类重要病害微生物，严重影响临床诊断、水与环境分析、食品安全及生物防治等诸多方面。特别是2013年在中国中部地区爆发的H7N9高致病禽流感，再次向人类提出控制和检测病原体已经成为一项非常必要与紧迫的任务。因此，建立有效的诊断方法对于病原体的防治以及提高动植物的品质都具有非常重要的意义。

马铃薯作为世界性粮食作物之一，长期受到多种马铃薯病毒的侵染，对马铃薯的产量与品质均造成严重的影响。在病毒侵染农作物长期共生进化过程中，寄主通过基因沉默抵御病毒的侵染，而病毒为了对抗寄主基因沉默防御机制产生了具有拮抗功能的沉默抑制因子，这些抑制因子具有解除或干扰宿主的基因沉默途径的功能(Olivier V,2001.,Lakatos L et al.,2006）。研究这些抑制因子，有助于深入理解病毒与宿主间的相互作用关系，对于进一步防御病原体的具有重要的意义。目前在马铃薯病毒中已发现马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)P0基因、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)16kDa基因、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)2b基因、甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus，BWYV）P0基因、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)HcPro(Helper component-proteinase)基因、马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX）P25基因具有抑制基因沉默的功能(Renovell et al.,2012;Moissiard and Voinnet2004;Chiu et al.,2010;Fukuzawa et al.,2010)，这六种抑制因子均是通过Argonaute(AGO)家族蛋白介导基因沉默。鉴于马铃薯能同时被多种病毒感染，极有可能多种抑制因子同时参与抑制多种病毒感染的现象，从而介导基因沉默的现象，同时由于参与介导基因沉默的抑制因子在马铃薯中的含量的比较低，因此，建立一种方法同时检测多种微量病原体就显得尤为迫切与必要。

目前涉及植物病原体的检测方法很多如：指示植物检测法、电镜技术、以蛋白为基础的免疫学方法、核酸介导的分子生物学方法。指示植物检测法（吴凌娟等，2003；徐洁，2002）具有检测便捷、操作简单等优点，但需要专门防虫温室，培养时间较长，而且需要定期杀虫与浇水。此外，指示植物与病毒种类的不同，采用的光照和温度培养的条件也相应的不同。这些条件制约着指示植物鉴定法的应用。吴兴泉等（2004）利用电镜技术成功鉴定带有花叶症状的马铃薯感染PVX病毒。但电镜技术受到以下限制：的操作环境必须是真空，对观察者的操作技术以及知识储备要求比较高，同时需要对所检测的生物样品进行取材、漂洗、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片以及染色等步骤的处理，消耗时间长（Naja et al.,2008;Nishiyama et al.,2010）。因此，利用电镜技术检测马铃薯病毒受到很大的限制。Singh et al（1992）利用免疫学方法成功区分PVY^N，PVY^O，PVY^N:O三种株系，但是Weidemann et al（1998）利用免疫学检测技术检测PVY^N和PVY^NTN时，出现血清交叉反应，并且检测结果不稳定。此外，免疫学检测方法不能用于纯度与含量低病毒以及缺少外壳蛋白的类病毒检测。同时该方法容易被污染易产生假阳性（Matic S et al.,2009）。