[发明专利]高灵敏食物过敏原检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种高灵敏食物过敏原检测方法，其特征在于，步骤如下： 

1）食物过敏原蛋白偶联磁珠，所述的食物过敏原包括但不限于水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白；

2）构建标准曲线：梯度稀释抗食物过敏原的IgG抗体标准品与食物过敏原蛋白偶联磁珠进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，根据平均吸光度值和相应的浓度进行线性回归，构建标准曲线；

3）筛查食物过敏原，利用食物过敏原蛋白偶联磁珠与过敏患者的血清进行免疫反应，然后利用抗人IgG二抗进行信号放大反应，然后根据得到的信号与步骤2）所得的标准曲线确定食物过敏原的种类及对应的抗体的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的信号放大反应为显色反应。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤3）中确定食物过敏原的种类的cut-off值设定为抗体浓度1ng/mL的值在标准曲线对应的吸光度值。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述的步骤1）中，具体方法如下：

1.1） 取一只5mL的离心管向其中分别加入3.84mL 50mM  pH4.0的磷酸盐缓冲液、1mL 5%的磁珠、60uL 50mg/mL的EDAC溶液和100uL 100mg/mL的NHS溶液，把离心管置于摇床上，室温条件下活化30min；

1.2） 将离心管置于磁力架上吸住磁珠，弃掉清液，并向离心管中加入5mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；重复洗涤3次，最后一次加入4.499 mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液；

1.3）再向其中加入5ug/mL的食物过敏原蛋白500uL，1%牛血清蛋白 1uL，把离心管置于摇床上，40℃条件下反应45min；

1.4）重复1.2）的洗涤步骤；

1.5）加入4.990mL 50mM pH6.5的磷酸盐缓冲液与10uL 1%BSA溶液，4℃条件下封闭保存待用。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤3）中，具体方法如下：

3.1） 取若干只2mL的离心管，分别加入300uL偶联食物过敏原蛋白的磁珠，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，然后加入300uL pH7.4的磷酸盐缓冲液，如此洗涤3次；

最后吸干；

3.2）向洗涤后的磁珠中加入120uL，含20%甘油，梯度稀释的抗体，室温条件下孵育40min；

3.3） 孵育结束后，用磁力架吸住磁珠，弃掉清液，再加入300uL的PBS洗涤液，漩涡震荡，再用磁力架吸住磁珠，如此洗涤5次，最后吸干液体；

3.4）向洗涤后的磁珠中加入100ng/mL 的辣根过氧化物酶标记的二抗120uL，含20%甘油，室温条件下孵育40min；

3.5）重复步骤3.3）；

3.6）向洗涤后的磁珠中加入100uL的 TMB显色液，避光反应15min；

3.7）避光反应后，向其中加入100uL 1moL/L的盐酸溶液，终止反应，并把液体转移到酶标板上；

3.8）用酶标仪读取吸光度值；

3.9）结果计算。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的磁珠的表面具有羧基、氨基或者无基团，粒径大小在100nm~3um。

7.一种根据权利要求1所述的方法的食物过敏原检测试剂盒，其特征在于，它包括但不限于已包被的水产类、奶类、蛋类、肉类、谷物类、坚果类、水果类、蔬菜类、豆类食物过敏原蛋白中的一种或多种的磁性纳米微球、人IgG标准液、辣根过氧化物酶标记二抗、TMB、样品稀释液、洗涤液和终止液，灵敏度范围不高于2pg/mL。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，适用于转基因食品的过敏原检测。