[发明专利]干扰EV71病毒2A蛋白酶基因的三个siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是干扰EV71病毒2A蛋白酶基因的三个siRNA及其应用，包括stealth siRNA-69stealth siRNA-294stealth siRNA-319。

背景技术

EV71病毒属于微小RNA病毒科肠道病毒A组，病毒基因组为单股正链RNA，大小约7500bp，病毒衣壳为二十面体立体对称球形结构，直径约为24-30nm，无包膜和突出。EV71感染主要引起手足口病，多发生于学龄前儿童，其临床症状主要表现为发热，手、足、口腔黏膜等部位出现疱疹，重症病例在发病1-5天后出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、肺水肿和循环障碍等症状，甚至死亡。1957年，加拿大首次报告手足口病，之后在欧洲、美洲和亚洲多个地区相继发生大流行。在我国，手足口病早有流行。1981年，上海首次报告了手足口病，2008年3月，安徽省阜阳市发生了较大规模的疫情，感染人数达176000人，并有23例死亡，随即在全国其他地区也出现了手足口病的疫情，引起了社会的恐慌。目前，尚无有效抵抗EV71的抗病毒药物，所以，寻找一种潜在有效的抗病毒方法是十分必要的。

RNA干扰是一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。研究中导入的双链RNA分子为具有基因沉默功能的大小约21-25核苷酸的双链小RNA分子(称为siRNA)，由RNAaseIII家族中对双链RNA具有特异性的酶Dicer加工而成。

近些年已经报道过以EV71基因的其他区域比如vp1，vp2，5’UTR，3’UTR，2C，3Cpro and3Dpol为靶序列化学合成siRNR治疗病毒的文章，但还没有以2A蛋白酶基因作为抑制病毒复制的靶标，所以本发明的目的是探讨以EV712A蛋白酶基因为靶序列化学合成的三个siRNA是否具有潜在的抗病毒作用。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供干扰EV71病毒2A蛋白酶基因的三个siRNA及其应用。

本发明的技术方案如下：

干扰EV71病毒2A蛋白酶基因的三个siRNA，包括如下表所示的三个siRNA：stealth siRNA-69、stealth siRNA-294、stealth siRNA-319：

所述的三个siRNA的应用，其与EV71病毒2A蛋白酶基因区域有效的互补结合，将病毒核酸降解，从而达到抑制病毒复制扩增的目的。

stealth siRNA-69，stealth siRNA-294，stealth siRNA-319是以EV712A蛋白酶基因为靶序列化学合成的三个siRNA，其可以与EV71病毒2A蛋白酶基因区域有效的互补结合，将病毒核酸降解，从而达到抑制病毒复制扩增的目的。以siRNA为基础的RNAi因其基因沉默的高度特异性和高效性，为病毒感染类疾病的临床治疗开辟了新的途径。

附图说明

图1为stealth siRNA抗病毒作用的检测结果；stealth siRNA抑制病毒RNA乱序siRNA作为阴性对照；模拟转染处理组为只用Lipo2000处理；仅病毒为只用病毒感染。三次独立实验数据用means±SD表示(**p<0.01)。

图2为stealth siRNA抑制病毒蛋白表达；actin作为内参对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1stealth siRNA的合成

在NCBI网站搜索EV712A蛋白酶基因序列(JN001860.1)，以此序列为靶目标由上海英骏公司化学合成三个siRNA,其作用原理为stealth siRNA转染进细胞后，结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，随后双链stealth siRNA在酶的作用下被分解成单链形成激活的RISC，激活的RISC通过碱基配对定位到同源的mRNA上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割靶mRNA,从而抑制mRNA的翻译。其序列见下表1。

表1三个stealth siRNA分子的相关序列与其在2A蛋白酶基因的位点

2stealth siRNA转染RD细胞及病毒感染