[发明专利]布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒

权利要求书

1.一种布鲁菌外膜蛋白抗体检测ELISA试剂盒，其特征在于，其利用大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白OMP28作为抗原包被酶标板，用布鲁菌标准阳性血清和阴性血清分别作为阳性对照血清和阴性对照血清，以HRP标记的羊抗牛IgG作为酶标抗体。

2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述大肠杆菌表达的布鲁菌外膜蛋白OMP28的制备方法如下：

（1）设计引物

根据牛型布鲁菌OMP28的基因序列设计引物：

上游引物为：5’-CGCGGATCCATGAACACTCGTGCTAGC-3'；

下游引物为：5’-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'；

在上、下游引物的5'端分别添加BamHI和XhoI酶切位点；

（2）OMP28基因的扩增

以牛型布鲁菌A544株基因组DNA为模板，扩增OMP28基因；

（3）克隆载体和表达载体的构建

用BamHI酶和XhoI酶将回收的OMP28PCR产物定向克隆于原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性重组质粒；

（4）重组蛋白的制备

将重组质粒pET-28a-OMP28转化到大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导表达，用Ni-NTA琼脂糖亲合层析纯化得到重组OMP28蛋白。

3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述OMP28基因的扩增步骤中，PCR扩增的工作体系为25μL：DNA模板1.0μL，10μmol/L上游引物F1.0μL，10μmol/L下游引物R1.0μL，2×Master Mix12.5μL，灭菌去离子水9.5μL；反应参数：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃1min，35个循环，72℃延伸7min，冷却至4℃。

4.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述筛选得到阳性重组质粒的具体过程为，将转化后的大肠杆菌DH5α细胞涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜，次日，从LB平板上随机挑取5个菌落，接种于含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养16h，提取质粒，进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的质粒再进行酶切鉴定，将酶切鉴定为阳性的质粒测序，得到阳性重组质粒。

5.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标板的制备方法如下：

（1）抗原包被：无菌条件下，将纯化的重组蛋白OMP28于pH9.6的碳酸缓冲液中按1μg/ml稀释，100μL/孔加到96孔酶标板中，湿盒内37℃包被1h；

（2）洗涤：以pH值为7.4的PBST作洗涤液，300μL/孔，每次室温作用2min，洗涤4次。最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干；

（3）封闭：用含5%脱脂乳的PBST按160ul/孔，加入至酶标板中，37℃封闭30min，洗涤4次。最后一次甩掉洗涤液后，在吸湿纸上用力排干，后自然晾干；

（4）包装：将封闭好的酶标板放于铝箔袋中，加入包装为1g的干燥剂，用真空包装机将酶标板包装好，贴标签。

6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清和阴性对照血清的制备方法如下：

（1）阳性对照血清的制备：在无菌条件下，将布鲁菌标准阳性血清，用2ml蒸馏水稀释，加入0.01%硫柳汞以防腐；

（2）阴性对照血清的制备：在无菌条件下，将布鲁菌标准阴性血清，用2ml蒸馏水稀释，加入0.01%硫柳汞以防腐。

7.根据权利要求1-6任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还配以洗涤液、底物溶液A、底物溶液B和终止液。

8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的制备方法如下：无菌条件下，用0.22μm滤器过滤后的Tween-20加到经高压灭菌的20×PBS中，配成1%的20×PBST贮存液。

9.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，终止液为2mol/L硫酸。