[发明专利]气相色谱-质谱检测细胞内中糖、氨基酸的方法

权利要求书

1.一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：

（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；

（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；

（3）样品衍生：在步骤2）得到的样品Ⅰ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品Ⅰ，收集上清得到待测胞内样品Ⅰ；

（4）利用气相色谱-质谱对步骤3）得到的待测胞内样品Ⅰ，进行分析和数据采集。

2.根据权利要求1所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。

3.根据权利要求1或2所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。

4.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280℃。

5.根据权利要求4所述一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的糖、氨基酸。

6.根据权利要求1~2或4~5任一项所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖；所述氨基酸为为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。

7.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内糖、氨基酸的方法，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖；所述氨基酸为为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。