[发明专利]一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及鉴定转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301及其衍生品系的检测方法及其所依赖的转化体特异序列。

背景技术

水稻是我国乃至世界最主要的粮食作物之一。水稻也是虫害发生较为严重的作物之一。我国水稻田间害虫有600多种上，其中分布广泛且为害较为严重的是二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫。据统计，每年我国由虫害造成的损失占水稻总产量的5％以上，高达一千万吨，每年用于水稻害虫防治的费用都在135亿元人民币以上。而在水稻品种及野生稻中没有抗鳞翅目害虫的种质资源可以利用。以转基因技术为核心的品种设计技术可以将远缘物种的抗性基因导入水稻中，从而使现有品种获得高抗虫特性。目前已经有多个转基因水稻品系获准进入环境释放和生产性试验。对转基因作物的有效监管是转基因作物安全利用的前提和保障。转基因作物外源序列插入片段旁侧序列是转基因植物品系的最重要的分子身份证。因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因作物品系特异性检测方法的重要技术资料。

mfb-MH3301是福建省农业科学院生物技术研究所和中国科学院遗传与发育生物学研究所共同研发的抗二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟以及大螟的具有广泛应用前景的转基因水稻品系。利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系）是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。

利用插入位点旁侧序列鉴定转基因品系，该方法已在鉴定克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号品系中建立。mfb-MH3301是最新研发的抗虫转基因水稻品系，尚无任何相关转基因水稻mfb-MH3301外源基因插入片段的旁侧序列文章报道和专利。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转Cry1Ab抗虫基因水稻品系mfb-MH3301的检测方法，属于生物技术领域，利用插入位点旁侧序列特异性地鉴定转基因品种（品系）是目前鉴定转基因作物最可靠最特异的检测方法，是准确鉴别区分同一转化体及其衍生品系的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述方法是转化体mfb-MH3301中外源基因Cry1Ab及其表达框在水稻染色体上插入片段及其旁侧特异序列SEQ ID NO:1及基于该序列建立的特异性PCR扩增鉴定技术。

所述旁侧序列为LB端旁侧序列，其LB端旁侧序列如SEQ ID NO:1所示。

依据LB端旁侧序列设计的特异性引物为：

正向引物G92：5’-GAGACATTAGTAGGCAGGAC-3’；

反向引物Bb3301-L1：5’-CGAGACATAACTGACAGAGGAGG-3’或 

Bb3301-L2：5’-CTACTCTATCGTTGTTTTTGAC-3’或

Bb3301-L3：5’-TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。

所述特异性引物中一条引物为依据SEQ ID NO:1中1-500位序列设计的正向引物；另一条引物为依据SEQ ID NO:1中501-2000序列设计的三条反向引物中的任一条。

转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的外源插入片段的旁侧序列的PCR检测方法，所述PCR扩增条带中含有SEQ ID NO:1中的一段序列。

依赖于外源基因插入片段旁侧序列的转Cry1Ab基因水稻品系mfb-MH3301的PCR检测方法，可依据LB旁侧序列检测1个插入在水稻9号染色体上的位置。上述1对引物可用于转基因水稻mfb-MH3301及其衍生品系的定性PCR检测。

转基因水稻mfb-MH3301所用载体见图1，用于转化目的基因Cry1Ab和选择标记基因hpt分别位于不同的二个独立T-DNA区域，其中一个T-DNA区含有35S启动子和选择标记基因hpt；另一个T-DNA区含有2条核基质结合区MAR系列、Ubi启动子和目的基因Cry1Ab。

本发明采用常规方法提取转基因水稻mfb-MH3301 DNA，利用Tail-PCR方法扩增得到LB旁侧序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列包括水稻基因组序列，位于水稻第9号染色体（GeneBank ID: NC-008402.2 ）的7709771-7710270位，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中1-500位的核苷酸序列完全相同；该序列还包括了转化载体pCDMARUBb-Hyg的部分序列，其核苷酸序列与SEQ ID NO:1中501-2000位的核苷酸序列完全相同。