[发明专利]一种源于里氏木霉的二硫键异构酶基因Trpdi2及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工和微生物基因工程领域，特别涉及一种源于里氏木霉的二硫键异构酶基因Trpdi2及其用途。

背景技术

由于纤维素酶资源及其纤维素酶生产能力，丝状真菌在过去的几十年受到了极大的关注，但是随着工业及生物医药的发展，人们希望利用具有强大的分泌能力的丝状真菌作为细胞工厂，更高效地生产内源及外源蛋白。

相对于其他的表达受体，丝状真菌作为外源蛋白的表达受体具有较大优势。相对于原核表达宿主，丝状真菌能够对外源蛋白进行如二硫键形成、糖基化、蛋白酶切割等翻译后加工过程；相对于酵母，丝状真菌的糖基化作用与哺乳动物更接近，能够避免酵母对于外源蛋白的过度糖基化；相对于哺乳动物细胞、昆虫等高等生物表达系统，丝状真菌具有生长速度快、成本更低、更易于形成规模等优势(钟耀华等，2010)。另外工业丝状真菌如里氏木霉、黑曲霉、和米曲霉等已被美国食品和药品管理局认定为GRAS(Generally Recognized as Safe)和食品添加剂范围的菌株，保证了其作为宿主菌株的安全性(张建军等，2009；刘德辉等，2010)。

其中，里氏木霉作为工业上广泛应用的菌株，自身蛋白分泌可以达到100g／L，但是作为宿主表达外源蛋白，产量只是维持在毫克水平，这主要是由于转录、翻译、翻译后修饰及分泌等多水平因素限制造成的(Nevalainen等，2005)。为了克服这些限制，人们也进行了一些工作，主要集中在使用强启动子、增加基因拷贝数、与内源基因融合表达等转录水平的操作上，虽然结果显示产物有一定程度的增加，但是有限的提高程度也表示转录水平并不是主要的限制因素，目前的主要研究开始转向翻译后过程。

在自身及外源蛋白被翻译后至分泌到胞外的过程中，会受到蛋白质的质量监控，只有正确折叠并具有正确结构的蛋白质才能被成功分泌(Saloheimo等，2012)。而二硫键的形成在蛋白质折叠过程中极其重要。二硫键是蛋白质多肽链内或链间两个半胱氨酸之间共价连接键，它的形成是氧化型蛋白质折叠和成熟过程中的重要步骤，它可以提高蛋白质的稳定性，降低蛋白酶对蛋白质的降解，并对蛋白质的结构及生物活性有重要影响。二硫键对蛋白质活性的影响机理主要分为三种：1.形成二硫键的半胱氨酸是酶的活性位点，其氧化还原状态决定酶的催化反应；2.二硫键靠近活性部位，通过影响酶活性中心基团的去向影响酶活性；3.通过二硫键维持蛋白质的特定构象以保证功能(王亮等，2011)。很多证据证实二硫键可以在体外自发形成，但是其速度远低于体内反应，因为体内二硫键的形成过程是在酶的催化作用下，通过电子在半胱氨酸和二硫键之间的传递实现的。存在于内质网上的二硫键异构酶系统负责里氏木霉中的二硫键形成，对于里氏木霉蛋白质的成熟十分重要。

当大量表达内源或外源蛋白时，里氏木霉翻译后过程负荷过重，导致内质网工具酶酶量的相对缺乏，会造成蛋白的错误折叠装配。而通过表达二硫键异构酶基因，可以提高蛋白质成熟过程中二硫键形成的能力，最终增加外源蛋白产量(Sha等，2013；Mukaiyama等，2010)。所以鉴定、克隆高活力的二硫键异构酶基因，可以为增加里氏木霉表达外源蛋白的能力，及体外恢复二硫键必需蛋白的活性提供工具。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种源于里氏木霉的二硫键异构酶基Trpdi2。

本发明的目的之二是提供含有上述源于里氏木霉的二硫键异构酶基因Trpdi2的表达载体及重组宿主细胞。

本发明的目的之三是提供源于里氏木霉的二硫键异构酶基因Trpdi2所编码的二硫键异构酶的用途。

本发明公开了一种从里氏木霉中(Trichoderma reesei)所分离的二硫键异构酶基因，其特征在于，其多核苷酸序列为(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

优选的是，其多核苷酸序列还为(c)所示：

(c)SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列(a)或(b)中多核苷酸序列的cDNA的序列：为SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列。

一种由如权利要求1所述的从里氏木霉中(Trichoderma reesei)所分离的二硫键异构酶基因所编码的二硫键异构酶。

优选的是，所述的二硫键异构酶其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。