[发明专利]鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，NDV)是当今世界上最严重的禽类传染病之一，被世界动物卫生组织( OIE) 列为必须报告的传染病。NDV是单链负股RNA病毒，整个基因组全长15586个核苷酸，分子量约为51~57 KD。NDV 编码6种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)、磷蛋白(Phosphate protein，P)、基质蛋白(Matrix，M)、融合蛋白(Fusionprotein，F)、血凝素神经氨酸酶(Haemagglutinin Neuraminidase Protein，HN)和高分子量的RNA聚合酶(Large protein，L)，其顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。随着现在养殖集约化、规模化的发展，新城疫病毒变异很快，近几年临床上流行的毒株以新城疫基因VIId型为主，现有Lasota等疫苗株已无法对临床野毒提供有效保护，免疫失败的案例时有发生，急需开发新一代疫苗。F蛋白是构成新城疫病毒(NDV) 致病性的分子基础之一，为新城疫病毒的主要保护性抗原，常被用为新城疫病毒基因工程疫苗的候选基因。F 蛋白基因编码一条由553个氨基酸组成的蛋白，包括信号序列(SS)、位于羧基端附近疏水的跨膜结构域(TM)和一个由25~30个氨基酸组成的细胞质结构域(CT)，其3个主要的抗原决定簇位于72、161、343位。1995年美国农业部正式批准重组新城疫病毒F基因的鸡痘病毒活载体苗商品化，该重组活疫苗免疫效果与常规ND疫苗相当，并且一次免疫即可保护鸡抵抗NDV强毒的攻击。因新城疫病毒F蛋白过大，原核中难于表达，而真核表达系统的成本又过高，针对新城疫病毒F蛋白研制的基因工程亚单位疫苗迟迟没有实现商品化。因此，对新城疫病毒F蛋白质结构进行预测，筛选新城疫病毒F蛋白主要抗原表位进行表达成为新城疫病毒病毒基因工程亚单位疫苗开发的一个热点。王杰等（2013年）采用大肠杆菌对含有主要抗原表位的新城疫病毒F蛋白部分序列实现了高效表达，进一步制备的疫苗可对免疫的鸡群实现保护，但其保护率偏低，仅为50%。

产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）是一类致人和幼畜腹泻的最常见的致病性大肠埃希菌，其产生不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT）不仅具有毒性作用，而且还具有良好的免疫原性和免疫佐剂作用。LT为寡聚蛋白，由一个A亚（28 KD）和5个B亚基（11.5 KD）经非共价键结合。B亚基（LTB）是LT的免疫原性部位，是受体结合部位，具有良好的免疫佐剂作用，已有多篇文献报道其用于疫苗的免疫佐剂。李润成等（2009年）将肠毒素LTB蛋白基因与口蹄疫VP1蛋白基因进行融合表达，发现LTB可有效促进口蹄疫VP1蛋白的免疫效果，增效明显。

本发明即是基于肠毒素LTB优良的免疫佐剂作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性设计的。

发明内容

本发明涉及一种鸡新城疫病毒F蛋白和肠毒素LTB的融合蛋白及应用，即将筛选的鸡新城疫病毒基因VIId型的毒株的F蛋白部分序列与具有免疫增强作用的肠毒素LTB蛋白通过Lingker序列连接获得的融合蛋白，并将该融合蛋白作为疫苗用于免疫应答。

本发明一个方面涉及一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的融合蛋白用于制备鸡新城疫病毒亚单位疫苗。

上述制备的亚单位疫苗，其制备方法如下：将96份融合蛋白与灭菌的4份吐温80搅拌混合作为水相；将94份注射用白油，6份加司本80、2份硬脂酸铝，混合均匀，高压灭菌后作为油相；按水相和油相体积比1:3比例混合乳化即可制备鸡新城疫病毒基因工程亚单位疫苗。

本发明的亚单位疫苗用于对雏鸡的免疫应答。

本发明是基于肠毒素LTB优良的免疫佐剂作用和新城疫病毒株F蛋白良好的免疫原性设计的。其具有以下几个优点：1、选用的鸡新城疫病毒从国内临床养殖的病鸡中分离，属于国内外文献报道的近几年国内流行的鸡新城疫基因VIId型毒株，以其制备的疫苗针对性更强、疗效更确切；2、表达的鸡新城疫病毒F蛋白的部分序列，既包含了F蛋白的主要抗原表位又实现了原核的高效表达，大大降低了生产成本；3、本发明将筛选的含主要抗原表位的鸡新城疫病毒F蛋白基因与具有免疫增强作用的肠毒素LTB蛋白基因通过Lingker序列连接获得融合蛋白。一次免疫操作就可以使雏鸡可以获得高效免疫保护。

具体实施方式：