[发明专利]气相色谱-质谱检测发酵液中氨基酸、糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化学检验测定技术领域，特别是涉及一种气相色谱-质谱检测发酵液中有机酸、糖的方法。 

背景技术

在利用气相色谱-质谱检测氨基酸、糖代谢物方面，目前已有相关技术报道，如专利201210046953.2，公布了一种气相色谱－质谱检测尿有机酸的方法，包括如下步骤：（1）对待检尿液样本完成尿酶处理；（2）加入内标品，采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；（3）对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；（4）采用上述1-3的步骤处理标准有机酸，得到标准有机酸样本；（5）采用气相色谱－质谱联用仪对标准有机酸样本和待检尿液样本进行检测；（6）以标准有机酸样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的有机酸进行定量。该专利发明主要应用领域为尿样检测，且该检测方法仅局限于有机酸代谢物的检测，不能同时检测氨基酸、糖两类代谢物。 

对于微生物胞内、胞外代谢物的检测研究，可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律，尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升，而且可确定菌体内的代谢通量分布，进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构，实现目标产物高效生物合成。 

目前对于发酵液中的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质，不可实现多类代谢物同时检测。由于发酵液中各成分含量复杂多样，对于样品的处理方法很关键，目前还没有相关发酵液中、细胞外代谢物的系统处理检测方法，使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合，成为微生物代谢组研究的热点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种气相色谱-质谱检测发酵液中氨基酸、糖的方法，弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白，克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。 

本发明的方案是通过这样实现的：一种气相色谱-质谱检测发酵液中氨基酸、糖的方法，检测方法步骤包括： 

（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；

（2）发酵液样品制备：取60~350ul步骤1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ与乙腈体积比为1:0.5~1.5，涡旋振荡，再离心收集上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50~300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ；

（3）样品衍生：在步骤2）得到的样品Ⅱ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品Ⅱ，收集上清得到待测胞内样品Ⅱ；

（4）利用气相色谱-质谱对步骤3）得到的待测胞内样品Ⅱ，进行分析和数据采集。

作为本发明的进一步限定，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。 

作为本发明的进一步改进，所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。 

作为本发明的进一步改进，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280℃。 

作为本发明的进一步改进，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的发酵液中的氨基酸、糖。 

作为本发明的进一步改进，其特征在于，所述氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸；所述糖为葡萄糖、果糖、木糖。