[发明专利]弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌细胞生长和转移的影响研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，属于生物技术领域。 

背景技术

肺癌是当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤，且发病率也正逐年上升，肺癌发病率和死亡率在许多国家均居恶性肿瘤之首。据估计，一年中死于肺癌的患者人数超过前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌总人数。大约85％肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其按病理组织学分为腺癌、鳞癌、大细胞癌等。大多数患者在诊断时已局部进展或远处转移。转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因，大约90％的肺癌患者死于肿瘤转移。因而进行深入研肺腺癌浸润、转移的分子机制很有必要。 

Furin是蛋白前体加工酶家族中的重要成员，许多重要的生理过程需要Furin的参与，如多肽与蛋白质激素的合成与分泌、膜受体的成熟、血浆蛋白前体的激活等；同时多种疾病的发生也与Furin密切相关，如病毒外壳蛋白和细菌外毒素的加工活化以及肿瘤的转移等。这些蛋白质在发挥活性之前需要经过蛋白转化酶对蛋白前体切割，然后才能成为有功能的蛋白质。包括Notch、Wnt、MTl-MMP、VEGF等在内的许多与肿瘤发生发展密切相关的蛋白质在体内成熟过程中，必须经过Furin等蛋白转化酶对其前体进行剪切，才能发挥生物学活性。而这些蛋白质中部分成员与肿瘤的发生、发展密切相关，Furin在多种肿瘤中高表达，可以作为肿瘤进展过程中的Marker，在某种程度上可以作为肿瘤预后的指标。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，以便更好地利用Furin抑制剂a1-PDX抑制Furin在肺腺癌A549细胞中表达，从而有效地为癌症治疗提供依据。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。 

一种弗林蛋白酶抑制剂对肺腺癌A549细胞生长和转移的影响研究方法，具体包括以下步骤： 

(1)MTT法检测细胞的增殖： 

对数生长期A549细胞接种到96孔板中(每孔5×103)，24h后开始加入不同浓度 的a1-PDX(200nM、400nM)继续培养24h-96h；每孔加入20μl MTT试剂(5毫克／毫升)溶液，并于37℃温育4小时。每孔加入150μL的DMSO溶解甲臜晶体，震荡溶解后检测490nm处的光密度。 

(2)A549细胞克隆形成能力检测： 

取对数生长期的单层培养细胞，用0.25％胰蛋白酶消化吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10％胎牛血清的1640培养液中，以1×103／ml的细胞密度接种于培养皿中；加入不同浓度的a1-PDX(200nM、400nM)置37℃、5％CO2的饱和湿度环境下，静置培养2周。弃去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min。去除固定液，吉姆萨染液染色10min，流水缓慢冲洗后空气干燥后，肉眼直接计数克隆并统计分析。 

(3)Hochest33342／PI双染法检测细胞凋亡： 

对数生长期细胞A549按1×104个／ml浓度接种于提前用多聚赖氨酸处理的盖片上。不同浓度的a1-PDX处理48h后，倾去培养液，加入预冷PBS洗涤细胞2次；调整Hocchst33342／PI染液浓度至终浓度5μg／ml，37℃避光染色15min；弃去染液，加入4％多聚甲醛4℃固定5min。在荧光显微镜下观察拍摄。 

(4)单层细胞迁移实验(wound healing)： 

A549细胞接种在6孔板，待生长至汇合度达100％时，用无菌的200μl的Tip头尖制成划痕(wound)，并用PBS洗涤细胞碎片。细胞处理同前。在指定的时间用倒置显微镜配备的数码相机拍摄受伤区域的细胞迁移情况。 

(5)Transwel1侵袭实验： 

不同浓度a1-PDX处理的A549细胞(1×105)接种于Transwell小室的上部腔室，含有200μl的RPMI1640培养基，但不含10％FBS。Transwell小室下部腔室被填充有500μl的完整的RPMI1640培养基，含10％FBS。使细胞迁移48小时，然后用4％甲醛将细胞固定，室温下孵育15分钟。去离子水洗涤后，0.1％结晶紫染色。在光学显微镜下拍摄迁移的克隆。 

(6)Western blot检测细胞迁移相关蛋白表达水平：