[发明专利]一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法

权利要求书

1.一种适用于大马士革玫瑰悬浮培养高效诱导不定芽的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

（1）外植体的获得

取长出14天的幼嫩叶片在自来水下冲洗干净，接着用浓度为75%的酒精表面消毒30s～40s，再在浓度为0.1%的升汞溶液中灭菌2min～6min，用无菌水漂洗3～5次，最后在无菌条件下将叶片剪成四周有伤口﹑且尺寸为1cm×1cm的叶片；

（2）愈伤组织的诱导

将剪切好的叶片接种在诱导愈伤组织培养基上，在温度为25℃±2℃、光照培养条件为500Lx～2000Lx的条件下培养，3周后将愈伤组织转到新鲜的诱导愈伤组织培养基上继代培养，每2周继代一次；

所述的诱导愈伤组织培养基的组成为：以MS培养基为基础，加入30g·L^-1的蔗糖，0.7%的琼脂，2mg·L^-1的谷氨酰胺，（3～5）mg·L^-1的2，4-D，（0.1～1）mg·L^-1的6-BA，10mg·L^-1的AgNO₃，pH调为5.8-6.2；

（3）单细胞分散

称取1g新鲜疏松的愈伤组织，加入浓度为0.1%的果胶酶，黑暗中25℃中静置12h～16h，再用电磁搅拌器低速搅动几分钟，即获得细胞悬液，然后用血球计数板进行计数，参照所测得的单位愈伤组织的细胞数目，称取适量的愈伤组织，放入液体培养基的三角瓶中，在50rpm，25℃±2℃连续振荡培养3周后，用100目的尼龙网过滤，可获得95%的单细胞；滤液用1500rpm的速度离心5min，离心后将2/3上清液倒掉，剩余的1/3摇匀，形成细胞悬液；

（4）细胞悬浮培养诱导不定芽

将细胞悬液倒入三角瓶中，根据需要的起始密度，补定量的新鲜的液体1/2MS分化培养液，三角瓶含有40ml的液体1/2MS分化培养液，摇床为50rpm，在温度为25℃±2℃、光照强度为1000-2500Lx条件下，每天光照16h，进行诱导不定芽的形成；

所述的液体1/2MS分化培养液的组成为：以液体1/2MS培养基为基础，加入（1.5-3）mg·L^-1的TDZ，（0.05-0.5）mg·L^-1的NAA，（0.1-1.0）mg·L^-1的6-BA，10mg·L^-1的AgNO₃，（0.1-0.3）mg·L^-1的水解酪蛋白，pH调至5.8-6.2；

接种密度为10⁵个/L，每11d继代一次，筛选在液体1/2MS分化培养基中继代2～3次的愈伤组织细胞系，将有绿色芽点细胞团从液体1/2MS分化培养基中取出，转入固体1/2MS分化培养基中继续培养，2-3周形成不定芽，该1/2MS固体分化培养基成分为：以1/2MS培养基为基础，附加1.0mg·L^-16-BA，0.5mg·L^-1NAA，0.7%的琼脂，质量分数为3%的蔗糖，pH调至5.8-6.2；

（5）苗的生根

待芽长至2-3cm，将诱导得到的芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所述的诱导生根培养基的组成为：以1/4MS培养基为基础，加入0.5mg·L^-1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的琼脂，0.1%～0.3%的活性炭；培养温度为25℃±2℃、光强为2000lx、光照16h/天，培养2-3周后即获得大量组培苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的浓度为0.1%的果胶酶加入方法是溶于培养液或者0.6mol/L的甘露醇溶液中，pH调至3.5。