[发明专利]一种茶树RNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及RNA提取领域，具体地是一种茶树RNA提取方法。

背景技术

茶树原产于我国西南地区，是一种喜温畏寒的多年生经济作物，从分子水平上挖掘优良茶树种质资源是一项很有意义的工作。随着现代分子生物学的发展，构建茶树cDNA文库、茶树基因克隆及表达分析、茶树microRNA分析等已经成为茶树生物技术研究的重点工作，而从茶树中提取出高质量的RNA是进行这些研究的关键步骤。

茶树是一种的多年生木本植物，富含多糖、多酚类物质，容易在核酸分离纯化时，与RNA相互作用，使得RNA降解，因此，用这些常规方法提取时往往效果较差。现有技术中常用的RNA提取方法包括CTAB法、Trizol法等，也有很多市售的RNA提取试剂盒，如史成颖等人利用传统CTAB法，提取获得了茶树嫩叶RNA（史成颖等，提取高质量茶树总RNA的方法研究，安徽农业大学学报，2007年，第34期第3版，360～363页），该茶树RNA的A260/280值为2.08～2.10，RNA浓度为845.5～901.2ng/μL，提取过程消耗了2天的时间。市售的植物RNA提取试剂盒种类较多，提取时间短，一般只需要2～4小时，但针对性不强，提取率和纯度不能很好地满足开展茶树基因工程实验需要。因此，需要寻找一种更加优化的方法，以达到进一步提高总RNA提取率的基础上缩短提取时间，同时保证RNA的高纯度及完整性的目的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种茶树RNA提取方法，以提供一种更加优化的方法，进一步提高茶树RNA提取率和纯度，缩短提取时间。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

一种茶树RNA提取方法，包括以下步骤：

（1）取茶树组织，加入茶树组织0.5～1.5倍重量的不溶性聚乙烯吡咯烷酮PVPP，液氮中研磨成粉末；

（2）将步骤（1）的粉末中加入提取液，每1g茶树组织加入4.5mL的提取液，混匀，每1g茶树组织中再加入250μL的β-巯基乙醇，水浴，得到粗样品；

（3）将步骤（2）的粗样品在4℃下离心，取上清转移至RNA提取试剂盒的过滤柱中，离心，获得上清液；

（4）将步骤（3）的上清液中加入0.5倍上清液体积的无水乙醇，混匀，获得粗提液；

（5）将步骤（4）的粗提液转移至RNA提取试剂盒的吸附柱中进行吸附，然后用RNA提取试剂盒中的去蛋白液和漂洗液洗涤吸附柱，最后用不含核酸酶的RNA-free水洗脱吸附柱上的RNA，获得茶树RNA。

优选地，所述步骤（1）中，茶树组织选自茶树嫩叶、成熟叶、茶树嫩根和茶树花蕾中的一种。

优选地，所述步骤（1）中，加入的PVPP重量与茶树组织的重量相等。

优选地，所述步骤（2）中，水浴温度为65℃，水浴时间为30min。

优选地，所述步骤（2）中，提取液的配方为：1.4mol/L的NaCl，重量百分比为2%的十六烷基三甲基溴化铵CTAB，100mmol/L的三羟甲基氨基甲烷的盐酸溶液Tris-HCl和20mmol/L的乙二胺四乙酸EDTA，溶剂为焦碳酸二乙酯DEPC水，pH8.0，配制后灭菌。

优选地，所述步骤（3）中，离心的转速为12000rpm，离心的时间为5min，将粗样品离心可以去除粗样品中的固体物质，避免后续将样品转入过滤柱时，固体物质堵塞过滤柱。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种茶树RNA提取方法，该方法是将现有技术的CTAB法与RNA提取试剂盒结合，在现有茶树RNA提取方法上做了进一步优化，用该方法提取茶树RNA的用时只需2小时，大大缩短了提取时间，同时，用该方法提取茶树RNA与现有技术相比，茶树RNA的提取率和纯度都有大幅度提高。

附图说明

图1为茶树嫩叶RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～3为3个重复；

图2为茶树成熟叶片RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～2为2个重复；

图3为茶树嫩根中RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～3为3个重复；

图4为茶树花蕾RNA的甲醛变性胶电泳图，其中泳道1～3为3个重复；

图5为用试剂盒提取的茶树嫩叶RNA的甲醛变性胶电泳图，其中1～2为2个重复。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。