[发明专利]检测WT1基因第7外显子多态性位点的方法和引物

说明书

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及检测WT1基因第7外显子多态性位点的方法和引物。

背景技术

WT1基因是最早发现的与Wilms肿瘤发生、发展相关联的基因，全长约50000bp，共有10个外显子，其等位基因的功能缺失在Wilms肿瘤的发生中起重要的作用。该基因所编码的蛋白，是一种锌指蛋白，相对分子质量为52000～54000，而且它也是一种双向转录调控因子。近年来发现在白血病尤其急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)中WT1基因有异常的高表达，而且表达水平与预后有关，高表达可能导致较差的预后。此外，还有多项研究显示，WT1突变与它的高表达水平的效果相类似，也大多与较差的预后相关。

AML是一类由造血祖细胞分化受阻及增殖异常而导致的血液系统恶性肿瘤。近年来在AML中鉴定出了多种有重要预后价值的分子标记，因基因突变导致的细胞增殖、分化和细胞凋亡途径的改变是AML的发病基础。如今，WT1基因第7外显子多态性的研究已成为AML的新的预后指标，有助于临床医师及早地识别正常核型AML患者中的不同亚型，以便尽可能早地对患者进行有效治疗。因此，快速、准确地诊断患者WT1第7外显子多态性的状况，对于临床上白血病尤其是AML患者的治疗和用药有极大的指导意义。

目前检测WT1基因第7外显子多态性位点的方法有限制性片段长度多态性（SSCP）,基因测序，荧光定量PCR等，SSCP技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断，由于方法本身的技术限制，检测灵敏度低。

采用荧光定量PCR法检测WT1基因第7外显子多态性位点时，采用荧光定量PCR的SYBRGreen染料法检测基因突变存在引物特异性差的问题，检测结果假阳性率很高。若要达到高特异性的要求，则应采取荧光定量PCR（探针法）的检测方法进行检测，但是由于检测的外显子序列较长并且涉及多个突变位点，所以需要设计多对引物及探针，既设计多条(至少三条)突变型探针分别与WT1基因第7外显子中相应的突变位点特异性结合，也要设计多条野生型探针分别与WT1基因第7外显子中相应的未发生突变的位点结合，即检测一个DNA样本需同时进行多管PCR反应，每管反应体系包括1对扩增引物，1条野生型探针，1条对应的突变型探针，对样本DNA的用量较大。此外，还需要使用与之相配套的实时荧光定量PCR仪，检测成本也会提高，给临床应用带来了不便。

焦磷酸测序技术由于检测的有效片段仅50bp左右，如果发生突变的多个位点之间相隔超过50bp的话，那么需要设计多对引物，并进行多管PCR反应，这也会成倍增加检测成本和样本DNA用量。此外，现有技术仅仅是检测突变发生概率较高的单位点突变，而没有检测WT1基因第7外显子的整体突变情况。

考虑到灵敏度、提高检测特异性和节约成本等因素，本发明设计了扩增WT1基因第7外显子多态性位点的正、反向扩增引物，并利用这对扩增引物对送检样本进行Touch-downPCR扩增，让PCR扩增产物纯化后变性，随后利用一对测序引物直接进行Sanger测序，就可以准确和特异性地检测WT1基因第7外显子多态性位点。其中，Touch-down PCR(也被称作降落PCR)是指每一个（或n个）循环退火温度逐步降低0.5至1℃，直到达到一个较低的退火温度，然后在该温度下继续循环10至20次左右。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。特别地，本领域技术人员不能保证每次提取出的样本DNA模板纯度非常高，而且即便所提取出的样本DNA模板纯度足够高，但是该DNA模板可能存在多个与目的基因同源性较高的序列，因此采用Touch-down PCR就可确保正、反向引物最大限度地与目的基因序列结合，从而提高扩增反应的特异性。

发明内容

本发明提供用于检测WT1基因第7外显子多态性位点的引物，所述引物包括：扩增WT1基因第7外显子多态性位点的正、反向扩增引物，其碱基序列为：

WT1-7-F:GGATCTGGAGTGTGAATGG

WT1-7-R:TTCTAACACCAACACGATTC。

进一步地，所述引物还包括一对测序引物，其碱基序列为：

WT1-7-S-F：GGATCTGGAGTGTGAATGG