[发明专利]一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法

说明书

技术领域：

本发明属于小麦分子标记辅助育种技术领域，涉及一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法。

背景技术：

籽粒硬度是国内外小麦市场分级和定价的重要依据。它能够影响面粉颗粒度大小、出粉率、润麦加水量、破损淀粉粒数量。硬度值小的小麦磨制的面粉颗粒度较小、破损淀粉含量低，吸水能力较弱，而硬度值大的小麦磨制的面粉颗粒度大、破损淀粉含量高，具有较强的吸水能力。这些特性的差异影响揉制面团特性，从而影响制作食品的类型。如软质小麦适合于制作饼干和糕点等甜食类食品；硬质麦面粉适合制作面包和优质面条等食品。

小麦的籽粒硬度性状主要由位于小麦5D染色体短臂上紧密连锁的Puroindoine a(Pina)和Puroindoine b(Pinb)基因调节，两个基因编码区在染色体上的间距为17kb。Pina和Pinb基因都处于野生状态时，籽粒表现为软质；当Pina或Pinb基因任一基因缺失或突变时，籽粒表现为硬质；当缺乏D组染色体时，籽粒硬度最大，称硬粒麦，又称杜伦麦(Durum)。目前，已在普通小麦中发现大量Pina和Pinb基因的突变类型，除少部分为片段缺失以外，多为单碱基突变。如常见的硬质小麦类型Pinb-D1b，是Pinb基因中223位点的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致该基因的氨基酸序列中第46位点的甘氨酸(Glycine，Gly)突变为丝氨酸(Serine，Ser)。

而目前SNP主要检测方法有如下缺陷：一、以凝胶电泳为基础的传统检测方法，如限制性片段长度多态性、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异PCR等，检测灵敏度低；二、核苷酸测序法，需要昂贵的3730测序仪，每个样品的成本在10元左右；三、基因芯片，同样需要昂贵的仪器，四、Taqman探针法，合成一条荧光引物的成本在300元左右。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种小麦籽粒硬度基因的SSR分子标记方法。

在NCBI数据库中检索到包含pina和pinb基因的BAC序列，该BAC库包含187kb的核苷酸序列，通过SSRfinder软件寻找到20个具有简单重复的序列，根据SSR位点的重复序列的特征和pina和pinb基因的距离核苷酸长度设计了4对PCR引物。SSR5的正向引物为GTTCGGGAGGTACCATATTT，反向引物为AGTGGGGGTTAAGGAGTG；SSR7的正向引物为CAAGTTTAGTTTCGCAAAA，反向引物为TGTATGTGCAACTTTGTGAAG；SSR9的正向引物为TTCAGCTTAACCATTCCTACA，反向引物为CCTTCGAACCTAATGAAATCT；SSR15的正向引物为TCGTACAGAGGGAAGTTCAG，反向引物为GCAGATGGAGTCTACACACTT。SSR5和SSR7引物具有有效扩增，而SSR7具有明显的多态性。在187个普通小麦品种中发现4种等位变异，测序后发现核苷酸长度分别为149bps，151bps，153bps，155bps。SSR7-1中AG重复17次，SSR7-2中AG重复18次，SSR7-3中AG重复19次，SSR7-4中AG重复20次，利用聚丙烯酰胺电泳可以清晰地将目标类型分开。对4中类型的不同品种的pina和pinb基因进行测序后发现，SSR7-3类型检测到野生型，SSR7-4类型中检测到Pinb-D1C突变，而SSR7-2类型检测到Pinb-D1B，而SSR7-1检测到Pinb-D1x。

本发明的有益效果为：SSR7所包含的由A和G两个碱基组成的基本序列串联重复组成的短片段，设计的SSR分子标记为共显性标记，仅采用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳即可完成，具有简便、快速、稳定性高和等位基因多样性高等优点。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下技术方案：它通过在与硬度基因紧密连锁的一个具有SSR特征的核苷酸序列中设计包含该SSR的PCR引物，对目标品种进行PCR扩增后，通过聚丙烯酰胺电泳，可以对品种间Pina和Pinb基因的等位变异进行判定。

所述的核苷酸序列为：