[发明专利]用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法

权利要求书

1.一种用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是包括构建文库、侧翼序列捕获及测序三部分；

所述的文库构建是将多聚核苷酸制成2Kb-5Kb的片段后，连接到质粒载体，然后转入第一感受态细胞进行扩大培养，获得混合质粒库；

所述的侧翼序列捕获是在未知序列附近的已知序列上设计PCR引物，并对混合质粒库进行扩增，并将消化的扩增产物转化入第二感受态细胞中，培养并获得克隆；

测序是对获得克隆进行测序，并利用生物信息学的手段，捕获已知序列周围的侧翼序列。

2.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的文库构建步骤如下：

1）将多聚核苷酸制成2Kb-5Kb的片段；2）将片段补平后，将平端连接到质粒载体；3）将载体转化入电转感受态细胞；4）对电转感受态细胞进行活化，在AMP抗性培养基中37℃进行扩大培养；5）将混合菌液库提取质粒，获得混合质粒库。

3.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的侧翼序列捕获步骤如下：

1）在未知序列附近的已知序列上设计PCR引物；2）使用两条引物扩增混合质粒库；3）将扩增产物进行消化1h～1.5h；4）将消化产物转化入感受态细胞中，涂板；5）过夜培养后挑克隆。

4.根据权利要求3所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的质粒载体为pUC19或pUC18。

5.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的消化使用dnp1酶。

6.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的多聚核苷酸为全基因组文库或RNA文库。

7.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的引物以拟突变的目标碱基为中心，在两侧加上一段序列，所述两侧的序列长度至少为11bp～12bp。

8.根据权利要求1所述的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的引物Tm值达到78℃。

9.一种用于对丹参基因组中已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，包括以下步骤：

首先，文库构建：

1）将丹参基因组DNA制成小于5Kb的片段；2）将片段补平后，将平端连接到pUC19或pUC18质粒载体；3）将载体转化入电转感受态细胞；4）对电转感受态细胞进行活化，在AMP抗性培养基中37℃进行扩大培养；5）将混合菌液库提取质粒，获得混合质粒库；

其次，侧翼序列捕获：

1）在未知序列附近的已知序列上设计PCR正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2；2）使用两条引物扩增混合质粒库；3）将扩增产物使用dnp1酶进行消化1h～1.5h；4）将消化产物转化入感受态细胞中，涂板；5）过夜培养后挑克隆；

最后，对得到的单克隆进行测序并分析测序结果，捕获已知序列周围的侧翼序列。

10.根据权利要求9所述的用于对丹参基因组中已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，其特征是所述的丹参基因组DNA制成的片段为1.5Kb-4Kb。