[发明专利]一种重组杆状病毒及制备方法以及在癌症疫苗制备中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能在哺乳动物细胞内高效表达DLL4蛋白的一种重组杆状病毒，以及该病毒的制备方法，以及该病毒在癌症疫苗制备中的应用。

背景技术

近些年，以肿瘤的某些特异性表面抗原为靶标开发的治疗性癌症疫苗的研究取得了丰硕的成果。目前，在美国已经有一批相关癌症疫苗获得FDA临床试验审批。然而，由于针对的癌细胞抗原的免疫原性较弱，无法激起较强而有效的免疫反应，以及用于表达抗原的质粒生产成本高等原因严重影响了该治疗手段的发展。

DLL4蛋白是Notch信号通路的一个配体，在血管生成过程中起到关键作用。据研究，在许多肿瘤中如乳腺癌、胃癌等都存在DLL4蛋白过表达现象，而在正常的乳腺或结肠中并未发现异常。已有实验研究表明：利用DLL4特异性抗体堵塞Notch信号通路，或者利用DLL4可溶性蛋白FC融合能够附束住Notch受体，阻滞DLL4的激活。这些实验显示了强有力的抗癌效应。另有研究也表明，Anti-DLL4-Ab表明很好的抗癌功效。

张浩、张耀洲等（“家蚕杆状病毒表面展示DLL4蛋白的肿瘤疫苗的研究”）利用Bac-to-Bac系统成功构建了表面展示DLL4蛋白的杆状病毒，将人源DLL4蛋白基因与GP64蛋白基因的信号肽基因和跨膜区基因连接后，与载体pFastBac1连接成功构建重组病毒。用该病毒对C57BL/6小鼠进行免疫实验，发现免疫了重组病毒后的小鼠血液中产生了针对DLL4蛋白的特异性抗体，肿瘤的生长也受到一定抑制。这与BKHaller等人的实验结果是相符的，对该方向的研究是一个重大鼓舞。但是，该重组病毒也存在上述癌症疫苗的普遍问题，即产生的免疫原性较弱，无法激起较强而有效的免疫反应，导致免疫效果不明显，免疫作用低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒稳定性好，宿主感染率高，表达能力强，能在哺乳动物细胞内高效表达DLL4蛋白，从而激起较强而有效的免疫反应。

本发明所采用的技术方案为：

一种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF，该病毒以杆状病毒表达载体Pfastbacdual为载体，包含有CMV-IE启动子、DLL4基因、gp64信号肽基因、DAF蛋白基因以及gp64跨膜区基因，其中gp64信号肽基因、gp64跨膜区基因分别连接在DAF蛋白基因的5’端和3’端。

上述重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF的制备方法，包括以下步骤：

（1）以CMV-N2-F（SEQIDNO：7所示）、CMV-N2-R（SEQIDNO：8所示）为引物，以PEGFP-N₂载体为模板，由PCR扩增方法得到CMV-IE启动子序列（SEQIDNO：14所示），然后以EcoR1和Sal1为酶切位点连接到Pfastbacdual载体中，得到Pfastbacdual-CMV重组质粒；

（2）以DLL4-sal1-F（SEQIDNO：9所示）、DLL4-not1-R（SEQIDNO：10所示）为引物，以pMD18-T-DLL4载体为模板，由PCR扩增方法得到DLL4蛋白基因（SEQIDNO：15所示），然后在DLL4蛋白基因的起始密码子前加入一段Kozaka序列（SEQIDNO：16所示），将得到的连接片段以Sal1和Not1为酶切位点连接到Pfastbacdual-CMV重组质粒中，得到Pfastbacdual-CMV-DLL4重组质粒；

（3）以gp64-SP-F（SEQIDNO：1所示）、gp64-SP-R（SEQIDNO：2所示）为引物，以野生杆状病毒基因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64信号肽基因序列（SEQIDNO：11所示）；以gp64-TM-F（SEQIDNO：3所示）、gp64TM-R（SEQIDNO：4所示）为引物，以野生杆状病毒基因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64跨膜区基因序列（如SEQIDNO：12所示）；以DAF-F（SEQIDNO：5所示）、DAF-R（SEQIDNO：6所示）为引物，以人源cDNA序列为模板，由PCR扩增方法得到DAF蛋白基因序列（SEQIDNO：13所示）；

（4）用重叠PCR的方法将gp64信号肽基因序列和DAF蛋白基因序列进行重叠拼接，得到SP-DAF片段，用重叠PCR的方法将SP-DAF片段与gp64跨膜区基因序列进行重叠拼接，得到SP-DAF-TM片段；