[发明专利]一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖领域，特别是涉及一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法。

背景技术

水产养殖动物具有低脂肪、高蛋白的特点，肉质鲜美，膳食结构合理，深受广大消费者的青睐。但随着水产养殖环境的恶化，复杂的水体环境使水产养殖动物体内常会滋生一些致病性微生物，如果这些致病微生物残留，富集在水产养殖动物体内就会严重危害食用者的健康。

副溶血性弧菌是众多致病性微生物中较为常见的一种，它是一种嗜盐性细菌，主要来自海产养殖鱼类，存活能力强，海水中可存活47天。食物中毒一般表现为急发病，临床上以腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。

目前，使用传统的检测方法，即非选择性和选择性增菌、生长法及血清学鉴定虽然比较准确，但费力、耗时，一般需4—7 d才能完成，这对水产养殖及后期的加工处理是不现实的。因此，急需一些快速、特异、敏感的检测方法来及时发现致病菌，控制污染及其可能对人体健康产生的危害。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，能够解决现有致病微生物检测方法存在的费时，费力，特异性不强的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，检测步骤包括：

（1）副溶血性弧菌阳性标本制备：取300～800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入1m³，含10条15～20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；

（2）副溶血性弧菌浓缩富集：分别取阳性标本和待测样本各4～5条，阳性标本和待测样本分别取20～100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2～4℃下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2～4℃静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；

（3）副溶血性弧菌核酸提取：将步骤（2）中5～10ml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取DNA；

（4）引物设计：上游引物AGACAACTATGATGCAGATTA  下游引物TGATCATCACGATAGAAATAG；

（5）模板制备：将步骤（3）中获得的提取液在-4℃下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15～30分钟；

（6）基因扩增：将步骤（5）中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增；

（7）PCR产物分析：将步骤（6）中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。

在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（1）中副溶血性弧菌原液体积为600ml。

在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（2）中标本和待测样本的鱼鳞分别为80mg。

在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（3）中的溶液为10ml。

在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（5）中放置温度为25℃。

在本发明一个较佳实施例中，所述步骤（6）中PCR扩增体系为10ⅩPCR缓冲液2uL，Taq 酶1ul，dNTPs混合物2ul，上下游引物各2ul，Mg²⁺6.6ul，超纯水5.4ul，模板1ul。

本发明的有益效果是：本发明一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，实现了水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌鉴定方法，这种方法省时，省力，检测灵敏度高，能够很好满足人们对水产养殖鱼类等日益严格的质量要求。并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。

具体实施方式

下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明实施例包括：

一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，检测步骤包括：

（1）副溶血性弧菌阳性标本制备：取300～800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入1m³，含10条15～20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；