[发明专利]用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞系领域，具体涉及用于观察乙肝病毒在胞内生命周期的人类肝癌细胞系及其应用。 

技术背景

全球各个地区都有乙肝病毒感染者，亚洲地区、南太平洋地区、非洲、新西兰等地区乙型肝炎病毒HBV是危害人类健康的主要病原体之一。中国是乙型肝炎的高发区，预防和治疗乙型肝炎是一项艰巨而重要的工作。 

乙型肝炎病毒属于嗜肝病毒DNA病毒科，只有很窄的宿主范围，如人乙肝病毒只能感染人或者灵长类的猩猩和狒狒，鸭乙肝病毒并不能自然传染给所有种系的家鸭。乙肝病毒的复制周期经动物体内和体外研究，尤其借鉴鸭乙肝病毒，阐述人乙肝病毒的复制周期。乙肝颗粒的外膜与宿主细胞接触，以前S蛋白附着和侵入细胞，但是病毒颗粒如何附着和侵入细胞还所知甚少，迄今的报道较多，但是无法真正确认。研究HBV感染人体的机制是解决问题的关键，但是由于缺乏敏感的细胞系和病毒可视化的方法，乙肝病毒如何进入细胞、如何在胞内运输、复制、表达及出胞等方面的研究仍然没有确切的方法证实。 

乙肝病毒C基因区相当保守，但在慢性感染中，多数变异集中在C基因区，这可能是由于核心抗原和E抗原有共同的T细胞表位，在HBeAg消失后，HBcAg承受免疫活性施加的选择压力，而C基因区的变异与基因型有关，所以C基因区变异有地理学的特点。我国的慢性乙肝病人常集中在AA48-60、AA84-101、AA147-155这几个序列中。 

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，提供了可以分泌可视化病毒颗粒的人类肝癌细胞系，此人类肝癌细胞系可以持续稳定观察乙肝病毒进入细胞、胞内运输、复制、表达及出胞等过程。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体，所述真核表达载体命名为pcHBV1.3-TC，所述真核表达载体以pcDNA3.1+为基本骨架，所述的乙肝病毒真核表达载体含有1.3倍乙肝病毒基因，所述的1.3倍乙肝病毒基因上还同时含有TC标签。 

进一步地，所述真核表达载体为： 

真核表达载体pcHBV1.3-TC-1，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第759个碱基后插入TC标签，或； 

真核表达载体pcHBV1.3-TC-2，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第906个碱基后插入TC标签，或； 

真核表达载体pcHBV1.3-TC-3，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第990个碱基后插入TC标签，或； 

真核表达载体pcHBV1.3-TC-4，其中，在1.3倍乙肝病毒基因上第1218个碱基后插入TC标签。 

编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒基因真核表达载体的方法，包括步骤如下： 

1）1.3倍乙肝病毒基因的获得 

以含1.3倍乙肝病毒基因的环形载体质粒pTHBV1.3为模板设计引物，扩增pTHBV1.3质粒上从5675位点顺时针方向到3270位点的片段，得到1.3倍乙肝病毒基因片段； 

2）1.3倍乙肝病毒基因真核表达载体的构建 

根据酶切位点分析，结合pcDNA3.1+真核表达载体的限制性酶切位点图谱，选用HindIII和NotI两个限制性内切酶对1.3倍乙肝病毒基因和pcDNA3.1+真核表达载体进行双酶切，分别回收酶切的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化感受态细胞，酶切鉴定，载体命名为pcHBV1.3； 

3）pcHBV1.3-TC真核表达载体的构建 

利用SOE-PCR技术，设计引物并将TC标签设计入引物内，进行PCR，得到编码TC嵌合型核心蛋白的乙肝病毒真核表达载体，命名为pcHBV1.3-TC。 

将构建的乙肝病毒基因真核表达载体转染到人类肝癌细胞中，得到人类肝癌细胞系， 

人类肝癌细胞系，该人类肝癌细胞系可以分泌乙肝病毒颗粒，所述的乙肝病毒颗粒的核心抗原不同位点上携带有一个TC标签。 

进一步地，所述人类肝癌细胞系包括四种人类肝癌细胞系，其中： 

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC2，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第2位氨基酸后插入TC标签，或； 

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC49，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第49位氨基酸后插入TC标签，或； 

一种人类肝癌细胞系，命名为：TC79，其乙肝病毒颗粒的核心抗原的第79位氨基酸后插入TC标签，或；