[发明专利]用反向载体法构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻

权利要求书

1.构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，用反向载体法调控pepc基因在丝状体鱼腥藻7120的表达，步骤包括：

（a）以鱼腥藻7120的基因组为模板钓取pepc基因；用PCR法扩增获得pepc基因；

所用的引物序列为：

上游5’-GATGGGCAAGCCACAAAAGACC-3’；

下游5’-AGGATCCGCGGGACGAGAAC-3’

（b）pepc基因与pRL-489质粒连接，构建反向穿梭表达载体并转入大肠杆菌；

（c）将含有辅助质粒和结合质粒的大肠杆菌、步骤（b）获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型蓝藻培养到对数生长中期，按照4.5～5.5:4.5～5.5:1的细胞数量比混合，通过三亲接合转移法用带pepc基因的载体转化蓝藻；

（d）用含抗生素的无氮BG11培养基或培养液筛选蓝藻转化子。

2.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，步骤（c）中，含有辅助质粒和结合质粒的大肠杆菌、步骤（b）获得的带有反向穿梭表达载体的大肠杆菌及纯化后的野生型蓝藻细胞数量比为5:5:1。

3.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，步骤（a）中，所述的pepc基因序列如SEQ ID No.1所示。

4.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，步骤（d）所述抗生素为卡那霉素或硫新霉素，所述的筛选蓝藻转化子的方法为：

（1）将混合后的细胞均匀涂在滤膜上，在无抗生素的BG11培养基上培养6～8天直至能看到蓝藻生长；

（2）然后在含抗生素浓度为15～30μg/mL的BG11培养基上培养18～24天筛选出对抗生素有抗性的蓝藻单藻落；

（3）挑选生长较好的鱼腥藻7120单藻落，置于抗生素浓度20～50μg/mL的培养液中培养5-8天；

（4）再经过2～4次逐级提高抗生素浓度的筛选培养，每次培养时间为5～8天，直至抗生素浓度提高到280～300μg/mL；

（5）用PCR技术检测工程蓝藻中的pepc基因，并用RT-qPCR法检测蓝藻中pepc基因表达。

5.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，步骤（b）中，鉴定反向穿梭表达载体的方法为：将所连接的载体用XbaI酶切后电泳，出现3个电泳条带的为反向穿梭表达载体。

6.权利要求1所述构建高油脂及高必需脂肪酸的丝状体工程蓝藻的方法，其特征在于，步骤（b）中，所述大肠杆菌为DH5α或Tp107。

7.权利要求1～6所述方法构建的丝状体工程蓝藻在生产脂肪酸或生物柴油方面的应用。

8.生产脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步骤包括：

（1）培养权利要求1～6所述方法构建的丝状体工程蓝藻；

（2）收集丝状体工程蓝藻并洗涤、冷冻干燥得到干藻粉，并从干藻粉中抽提脂类物质。

9.权利要求8所述生产脂肪酸或生物柴油的方法，其特征在于，步骤（1）所述培养条件为：

培养液：无氮的BG11培养液或培养基，pH=8.3～8.6；

温度30±1℃，以白光或者白光与蓝光和红光混合作为光源，搅拌条件下培养5～8天；光照强度为50-80μmol·m^-2·s^-1；

搅拌的方式为振荡培养或通气培养；振荡培养的转速为120～150rpm；通气培养为通入含1%～2%体积比CO₂的空气。